实时定量PCR技术原理及标记方法详解
实时荧光定量pcr（quantitative real-time pcr）简称qpcr，是一种在dna扩增体系中加入荧光基团，通过聚合酶链式反应（pcr）循环实现荧光信号的积累，从而实现检测每次pcr循环后产物总量的一种方法，是核酸检测和定量分析的“金标准”。
技术原理
实时荧光定量pcr根据所使用的荧光标记方法可分为两种：荧光染料（sybr green i染料为主）和荧光探针（taqman探针）。
①sybr green i染料法
sybr green i染料是一种结合于所有双链dna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。这种染料在反应体系中处于游离状态时，发出的荧光极其微弱，但当其与dna双链结合的时候，荧光信号就会被放大，从而被仪器所检测。在pcr实验中，染料的结合量与dna的浓度呈现正比关系，所以我们可以通过检测荧光信号的强度来反映pcr体系中dna的浓度。
优点：可用于检测任何双链dna序列的扩增，无需单独设计探针，操作简单，成本较低。
②taqman探针法
taqman荧光探针是进行荧光检测的另一种方法。taqman荧光探针是由5’端的荧光报告基团、3‘端的荧光淬灭基团和靶基因特异性结合的序列构成。当探针在反应体系中处于游离状态时，荧光报告基团的信号会被荧光淬灭基团所吸收。但当pcr进行到退火、延伸阶段时，dna聚合酶会将荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而发出荧光，因此探针法也可以通过检测荧光信号强度来反应pcr体系中dna的浓度。
优点：荧光探针只与目的序列结合，具有良好的特异性，无需实验优化；不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，兼容多重反应。
常见术语：
ct值：c代表cycle，t代表threshold，即指qpcr在扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。
惰性参比染料（rox）：用作荧光信号标准化内部参照，可以逐孔校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。
扩增曲线：amplification curve ，随着pcr反应的进行，荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强，通过荧光强度来检测扩增产物的变化。
扩增效率：一个dna分子扩增为2个dna分子，这种情况下的扩增效率为100。实际上会出现偏高和偏低的情况，90-110%之间。
溶解曲线：melting curve，是指扩增反应结束后，对双链dna进行升温处理，此时，dna双链逐渐解开，染料脱落，荧光值下降，荧光值随温度变化的曲线即“溶解曲线”，可用来判断体系中是否含有引物二聚体和非特异性扩增。
ntc：无模板对照（no template control），是指扩增反应中，模板通常用水来代替，用于检测试剂污染或外源dna造成的污染。
义翘神州提供实时定量pcr分析服务，服务内容和服务案例详情可以参看：cn.sinobiological com/services/real-time-pcr-service
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优点：可用于检测任何双链dna序列的扩增，无需单独设计探针，操作简单，成本较低。
②taqman探针法
taqman荧光探针是进行荧光检测的另一种方法。taqman荧光探针是由5’端的荧光报告基团、3‘端的荧光淬灭基团和靶基因特异性结合的序列构成。当探针在反应体系中处于游离状态时，荧光报告基团的信号会被荧光淬灭基团所吸收。但当pcr进行到退火、延伸阶段时，dna聚合酶会将荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而发出荧光，因此探针法也可以通过检测荧光信号强度来反应pcr体系中dna的浓度。
优点：荧光探针只与目的序列结合，具有良好的特异性，无需实验优化；不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，兼容多重反应。
常见术语：
ct值：c代表cycle，t代表threshold，即指qpcr在扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。
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溶解曲线：melting curve，是指扩增反应结束后，对双链dna进行升温处理，此时，dna双链逐渐解开，染料脱落，荧光值下降，荧光值随温度变化的曲线即“溶解曲线”，可用来判断体系中是否含有引物二聚体和非特异性扩增。
ntc：无模板对照（no template control），是指扩增反应中，模板通常用水来代替，用于检测试剂污染或外源dna造成的污染。
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