液相色谱柱的分类(按色谱固定相基质分)
1.硅胶基质:
1.1反相色谱柱:
反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有c18(ods)、c8(mos)、c4(b)、c6h5(phenyl)等。
1.2正相色谱:
正相色谱用的固定相通常为硅胶(silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团(nh2,aps)和氰基团(cn,cps)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(sioh)或其他团的极性较强,因此,分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小,即极性强弱的组份先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(hexane),,二氯甲烷(methylene chloride)等。
1.3离子交换色谱柱:
以磺化交联强阴/阳离子键合硅胶色谱柱,常用规格:强阴离子色谱柱(sax),强阳离子交换色谱柱(scx)
2.聚合物基质:
聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要优点是在ph值为1~14均可使用。相对与硅胶基质的c18填料,这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低。
所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于hplc的高交联度聚合物填料,其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易渗入聚合物基质中,因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢,所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物,聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此,聚合物基质广泛用于分离大分子物质。
色谱柱的选择
液相色谱仪基质的选择大致遵循以下法则,硅胶基质的填料被用于大部分的hplc分析,尤其是小分子量的被分析物,聚合物填料用于大分子量的被分析物质,主要用来制成分子排阻和离子交换柱。
色谱柱在使用前,建议进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是较佳的条件),只有这样,测得的结果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
色谱柱的维护
1. 色谱柱的平衡
反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱,您就会在处理问题方面获得大的“补偿“。
2. 色谱柱的再生
*使用的色谱柱,往往柱效会下降(柱子的理论塔板数减低)。可以对色谱柱进行再生,在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。建议用来冲洗柱子的溶剂体积。
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