经典回顾|基于M22的TRAb检测方法
来自rsr firs 实验室的 sanders等发现[5]，小鼠促甲状腺激素单克隆抗体与促甲状腺激素受体(tshr）的结合，可以被促甲状腺激素受体自身抗体(trab)所抑制。实验室用放射性125i标记的人tshr单克隆抗体(m22™)构建了一种分析方法[6]。
本文我们描述了一种检测trab的新方法，其中trab竞争抑制了促甲状腺激素受体人单克隆抗体m22(生物素标记)与包被于酶联免疫法(elisa)微孔板上的tshr的结合。同时我们将基于m22与基于tsh结合抑制的方法进行了比较。
研究对象与方法
检测方法
三代trab（rsr促甲状腺激素受体抗体检测试剂盒）：基于m22与血清中trab竞争抑制的elisa法。trab每次检测均包括一套使用正常混合血清(hbd pool)稀释后的tshr自身抗体国际标准物质nibsc90/672。结果以每升m22-生物素结合的百分比抑制率为单位(1-[检测血清的od450/hbd的od450])×100。
二代trab（rsr促甲状腺激素受体抗体检测试剂盒）：基于tsh与血清中trab竞争抑制的elisa法。
放免法：southgate等人[7]所述，利用trab与125i标记的tsh间竞争结合可溶性猪tshr的机制测定血清中trab含量(rsr试剂盒)。
甲状腺过氧化物酶(tpoab)和甲状腺球蛋白(tgab)的自身抗体采用beever等人[8]的直接测定法测定。tpoab单位u/ml(nibsc 66/387)，测量范围为1.5 - 500 u/ml；tgab单位u/ml(nibsc 65/093)，测量范围为3 - 1000 u/ml。
结果
标准物质90/672在三种不同的tshr自身抗体检测法中的剂量-效应关系见图1。
图1 90/672对促甲状腺激素受体(tshr)与抗体结合抑制的影响。
标准物质90/672 浓度为0.2 u/l时，对m22-生物素结合的抑制率约为10%；浓度为0.8 u/l时，对tsh-生物素结合的抑制率约为10%。在基于peg的实验中，125i标记的tsh结合抑制率约为10%时，标准物质浓度约为2 u/l。
在相同结合抑制率（10%）的前提下，标准物质浓度由小到大依次为：m22-biotin，tsh-biotin，125i-tsh(peg)。
三代trab的批内检测精密度：
对一份正常混合血清进行64次测量得到的平均值±标准差(sd)为0.041±0.04 u/l (450 nm处的平均吸光度=2.1±0.079)，表明该检测法的检测下限（2倍sd）为0.12 u/l。
三代trab的批间精密度如下（图2）：在0.3 u/l时为14%，在6 u/l时为6.5%。
二代trab的批间cv值，在1 u/l时为20%，在4 u/l时为6%。
图2 不同患者血清间变异系数(cv)与trab浓度的关系图。
三代trab测定m22结合的抑制率如下：
图3 基于m22-生物素对tshr结合的抑制，使用elisa检测不同患者组的自身抗体。mg，重症肌无力；sle，全身性红斑狼疮；ra，类风湿性关节炎；hbd，健康献血者。
在108例graves组中三代trab与二代trab之间结合抑制率的相关系数r值为0.99，如图4所示。
图4 比较m22-生物素对tshr包被的elisa板孔和tsh-生物素对tshr包被的elisa板孔的抑制作用，来自108名graves病患者(治疗和未治疗)。如图所示的线与每个轴呈45度角。通过图上的点进行最佳拟合的直线(未显示)的方程是y=1.084x-10.56，r=0.99。
三代trab、二代trab和125i-tsh（放免法）检测trab的受试者工作曲线(roc)[9]见图5。在此分析中，灵敏度数据来自108例graves病组。特异性数据来自60例无临床甲状腺疾病证据的患者(和临床工作人员)组。当特异性为100%时，三代trab、二代trab和放免法的灵敏度分别为95%、89%和62%。
图5 三种不同tshr自身抗体检测的灵敏度与100-特异性的关系图。
干扰性研究中，tsh (nibsc 94/674)最高达3 u/l，人绒毛膜促性腺激素(hcg) (nibsc 75/589)最高达160 u/ml，促卵泡激素fsh (nibsc 92/640)最高达69 u/ml，促黄体生成素lh (nibsc 80/552)最高达10 u/ml，对m22-生物素与tshr的结合没有影响(结合的最大抑制率为0%)。
讨论
我们的结果表明，三代trab与二代trab及其类似方法相比，可以检测出更低浓度的trab标准物质(nibsc 90/672)。 三代trab的精密度优于二代trab产品。
在108例graves病组，几乎所有的样本用三代trab比二代trab有更好的竞争抑制效果。以二代检测抑制率为20%为对照，只有1份血清样本在基于m22检测的三代检测中具有明显较弱的效果(14%抑制率)(图4；结果经多次重复测定证实)。
在307例对照组(包括临床工作人员、健康献血者和未诊断为graves病的患者)中，只有2例(0.65%)对m22结合的抑制率大于10%。其中一例患者(三代trab抑制率11%)报告过度疲劳(无明确原因)，另一例患者(三代trab抑制率12%)有原发性甲状旁腺功能减退和自身免疫性甲状腺功能减退。目前尚不清楚这些低检测值(在反复试验中得到证实)是试验中非特异性干扰的结果，还是与低水平trab有关。但在二代trab和放免法中，两例患者的血清均为trab阴性，但两例患者的血清均含有tpo自身抗体(按先后顺序分别为20 u/ml和70 u/ml)。
在特异性方面，三代trab不受tpo自身抗体或tg自身抗体的影响，在18例自身免疫性甲状腺功能减退患者中的17例未观察到抑制现象，17例患者中一些患者一种或两种自身抗体水平较高(9/17例tpoab水平大于500 u/ml，4/17例tgab水平大于1000 u/ml)。同样，乙酰胆碱受体、dsdna和类风湿因子的自身抗体均不抑制m22的结合(图3)，进一步强调了该试验的特异性。此外，高浓度的tsh(最高达3 u/l)、fsh(最高达69 u/ml)、lh(最高达10 u/ml)或hcg(最高达160 u/ml)对检测没有任何干扰。
图5所示的roc图显示，在108例graves病组中，有5例(4.6%)trab检测为阴性。在这5例患者中，患者a因甲状腺相关眼病接受甲状腺素(t4) (有131i治疗史)和糖皮质激素治疗；患者b予卡比马唑+t4治疗5年；患者c卡比马唑停药9年，采血前甲状腺功能正常；d患者接受t4治疗(1976年用131i治疗)。患者e在进行trab检测时没有临床资料。二代trab测定a-e患者血清中trab均为阴性(均小于1 u/l，抑制率小于10%)，放免法结果呈阴性或在灰区(tsh结合的抑制率为6% - 15%)。此外，5份血清中均未检测到tg自身抗体，1份血清中tpo自身抗体水平较低(2.5 u/ml)。我们无法在这5份血清中检测到trab，这可能与5例患者中至少4例在临床和生化特征，以及对tshr缺乏主动免疫反应的原因有关。
二代trab能检测到96/108(89%)的graves病血清，特异性为100%。二代elisa结果阳性的样本，在三代elisa中均能检测到。roc曲线同时强调，相比于放免法，固相包被tshr的elisa方法更有优越性。在放免法中，100%的特异性情况下，108份graves血清中只有67份(62%)被检测到trab，其灵敏度明显低于本文介绍的新trab测定方法。
基于标记的tshr单克隆抗体检测tshr自身抗体的方法已有报道[5,6]。然而，基于纯化graves患者igg检测tshr自身抗体的方法早在几十年前就有报道[10,11]。然而，在tshr自身抗体检测中，与亲和纯化的患者血清自身抗体作为配体相比，人或动物tshr单克隆抗体确实具有相当大的优势，例如这类单抗容易生产为大批量、质地均匀、纯净且稳定的制剂。单克隆抗体也相对容易操作(例如，通过片段化或突变)，以获得适合特定测定系统的制剂。
三代trab与二代trab间检测graves病血清trab结果密切相关(r=0.99)。此外，来自firs 实验室的sanders等人也观察到一系列graves病患者血清在抑制小鼠促甲状腺激素受体单克隆抗体对tshr的结合抑制，以及患者血清对标记tsh和tshr之间的结合抑制间的密切关系[5]。此外，无论自身抗体是常见的刺激型还是少见的阻断型，对受体的结合效果似乎效果接近[5,6,13]。这些早期的研究和目前的报道都强调了患者血清中tshr自身抗体(无论刺激型或阻断型)、tsh和促甲状腺单克隆抗体(包括m22™)在tshr上的结合位点之间的密切关系。然而，研究结果与有关tshr不同区域参与tshr自身抗体与tsh激动剂和tsh拮抗剂特性结合的报道不一致[14-16]。
总之，我们所描述的基于m22-生物素的trab的最新第三代检测方法比起早期检测方法有相当大的优势，在检测低水平自身抗体方面是非常可靠的。尤其需要评估低水平tshr自身抗体检测，三代trab在早期轻度graves病患者和有graves病眼部体征但无甲亢史的患者中具有应用价值。
想了解更多关于自身免疫性疾病及抗体检测的知识，请点击上方小程序，关注本公众账号。
参考文献 smith b r , bolton j , young s , et al. a new assay for thyrotropin receptor autoantibodies[j]. thyroid, 2004, 14(10):830-835.
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结果
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图1 90/672对促甲状腺激素受体(tshr)与抗体结合抑制的影响。
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图2 不同患者血清间变异系数(cv)与trab浓度的关系图。
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在特异性方面，三代trab不受tpo自身抗体或tg自身抗体的影响，在18例自身免疫性甲状腺功能减退患者中的17例未观察到抑制现象，17例患者中一些患者一种或两种自身抗体水平较高(9/17例tpoab水平大于500 u/ml，4/17例tgab水平大于1000 u/ml)。同样，乙酰胆碱受体、dsdna和类风湿因子的自身抗体均不抑制m22的结合(图3)，进一步强调了该试验的特异性。此外，高浓度的tsh(最高达3 u/l)、fsh(最高达69 u/ml)、lh(最高达10 u/ml)或hcg(最高达160 u/ml)对检测没有任何干扰。
图5所示的roc图显示，在108例graves病组中，有5例(4.6%)trab检测为阴性。在这5例患者中，患者a因甲状腺相关眼病接受甲状腺素(t4) (有131i治疗史)和糖皮质激素治疗；患者b予卡比马唑+t4治疗5年；患者c卡比马唑停药9年，采血前甲状腺功能正常；d患者接受t4治疗(1976年用131i治疗)。患者e在进行trab检测时没有临床资料。二代trab测定a-e患者血清中trab均为阴性(均小于1 u/l，抑制率小于10%)，放免法结果呈阴性或在灰区(tsh结合的抑制率为6% - 15%)。此外，5份血清中均未检测到tg自身抗体，1份血清中tpo自身抗体水平较低(2.5 u/ml)。我们无法在这5份血清中检测到trab，这可能与5例患者中至少4例在临床和生化特征，以及对tshr缺乏主动免疫反应的原因有关。
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基于标记的tshr单克隆抗体检测tshr自身抗体的方法已有报道[5,6]。然而，基于纯化graves患者igg检测tshr自身抗体的方法早在几十年前就有报道[10,11]。然而，在tshr自身抗体检测中，与亲和纯化的患者血清自身抗体作为配体相比，人或动物tshr单克隆抗体确实具有相当大的优势，例如这类单抗容易生产为大批量、质地均匀、纯净且稳定的制剂。单克隆抗体也相对容易操作(例如，通过片段化或突变)，以获得适合特定测定系统的制剂。
三代trab与二代trab间检测graves病血清trab结果密切相关(r=0.99)。此外，来自firs 实验室的sanders等人也观察到一系列graves病患者血清在抑制小鼠促甲状腺激素受体单克隆抗体对tshr的结合抑制，以及患者血清对标记tsh和tshr之间的结合抑制间的密切关系[5]。此外，无论自身抗体是常见的刺激型还是少见的阻断型，对受体的结合效果似乎效果接近[5,6,13]。这些早期的研究和目前的报道都强调了患者血清中tshr自身抗体(无论刺激型或阻断型)、tsh和促甲状腺单克隆抗体(包括m22™)在tshr上的结合位点之间的密切关系。然而，研究结果与有关tshr不同区域参与tshr自身抗体与tsh激动剂和tsh拮抗剂特性结合的报道不一致[14-16]。
总之，我们所描述的基于m22-生物素的trab的最新第三代检测方法比起早期检测方法有相当大的优势，在检测低水平自身抗体方面是非常可靠的。尤其需要评估低水平tshr自身抗体检测，三代trab在早期轻度graves病患者和有graves病眼部体征但无甲亢史的患者中具有应用价值。
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