RT-PCR反应体系灵敏度提高方法
逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，rt-pcr)的原理是：提取组织或细胞中的总rna，以其中的mrna作为模板，采用oligo（dt）或随机引物利用逆转录酶反转录成cdna。再以cdna为模板进行pcr扩增，而获得目的基因或检测基因表达。rt-pcr使rna检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量rna样品分析成为可能。
提高rt-pcr反应体系的灵敏度几个方法：
1、分离高质量rna
成功的cdna合成来自高质量的rna。高质量的rna应保-证全长并且不含逆转录酶的抑制剂如edta或sds等，以及尽可能减少基因组dna污染。rna的质量决定了你能够转录到cdna上的序列信息量的大值。
2、使用无rnaseh活性的逆转录酶
在逆转录反应中经常加入rnase抑制剂以增加cdna合成的长度和产量。不管是m-mlv还是amv，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源rnaseh活性。rnaseh活性同聚合酶活性相互竞争rna模板与dna引物或cdna延伸链间形成的杂合链，并降解rna：dna复合物中的rna链。被rnaseh活性所降解的rna模板不能再作为合成cdna的有效底物，降低了cdna合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的rnaseh活性将会大有裨益。
3、提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于rna二结构的打开，增加了反应的产量。对于多数rna模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将rna和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二结构，从而使引物可以结合。
4、促进逆转录的添加剂
包括甘油和dmso在内的添加剂加到*链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开rna二结构，多可以加入20％的甘油或10％的dmso而不影响superscriptⅱ或m-mlv的活性。amv也可以耐受多20％的甘油而不降低活性。
5、rnaseh处理
在pcr之使用rnaseh处理cdna合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，在cdna合成反应中的rna会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，rnaseh处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cdna目标模板时，rnaseh处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅱ。对这种困难模板，rnaseh的处理加强了superscriptⅱ或amv合成的cdna所产生的信号。对于多数rt-pcr反应，rnaseh处理是可选的，因为95℃保温的pcr变性步骤一般会将rna：dna复合物中的rna水解掉。
6、小量rna检测方法的提高
当仅有小量rna时，rt-pcr尤其具有挑战性。在rna分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入trizol的同时加入无rnase的糖元。对于小于50mg的组织106个培养细胞的样品，无rnase糖元的建议浓度为250μg/ml。在使用superscriptⅱ的逆转录反应中加入乙酰化bsa可以增加灵敏度，而且对于小量rna，减少superscriptⅱ的量并加40单位的rnaseout核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在rna分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用superscriptⅱ进行逆转录反应时加入bsa或rnase抑制剂。
7、减少基因组dna污染
rt-pcr所遇到的一个潜在的困难是rna中有基因组dna污染，可以在逆转录之使用扩增的dnaseⅰ对rna进行处理以除去沾染的dna。将样品在2.0mm edta中65℃保温10分钟以终止dnaseⅰ消化。edta可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的dna水解。为了将扩增的cdna同沾染的基因组dna扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cdna的pcr产物会比来源于污染的基因组dna的产物短。另外对每个rna模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组dna还是cdna。在无逆转录时所得到的pcr产物来源于基因组。
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2、使用无rnaseh活性的逆转录酶
在逆转录反应中经常加入rnase抑制剂以增加cdna合成的长度和产量。不管是m-mlv还是amv，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源rnaseh活性。rnaseh活性同聚合酶活性相互竞争rna模板与dna引物或cdna延伸链间形成的杂合链，并降解rna：dna复合物中的rna链。被rnaseh活性所降解的rna模板不能再作为合成cdna的有效底物，降低了cdna合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的rnaseh活性将会大有裨益。
3、提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于rna二结构的打开，增加了反应的产量。对于多数rna模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将rna和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二结构，从而使引物可以结合。
4、促进逆转录的添加剂
包括甘油和dmso在内的添加剂加到*链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开rna二结构，多可以加入20％的甘油或10％的dmso而不影响superscriptⅱ或m-mlv的活性。amv也可以耐受多20％的甘油而不降低活性。
5、rnaseh处理
在pcr之使用rnaseh处理cdna合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，在cdna合成反应中的rna会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，rnaseh处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cdna目标模板时，rnaseh处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅱ。对这种困难模板，rnaseh的处理加强了superscriptⅱ或amv合成的cdna所产生的信号。对于多数rt-pcr反应，rnaseh处理是可选的，因为95℃保温的pcr变性步骤一般会将rna：dna复合物中的rna水解掉。
6、小量rna检测方法的提高
当仅有小量rna时，rt-pcr尤其具有挑战性。在rna分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入trizol的同时加入无rnase的糖元。对于小于50mg的组织106个培养细胞的样品，无rnase糖元的建议浓度为250μg/ml。在使用superscriptⅱ的逆转录反应中加入乙酰化bsa可以增加灵敏度，而且对于小量rna，减少superscriptⅱ的量并加40单位的rnaseout核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在rna分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用superscriptⅱ进行逆转录反应时加入bsa或rnase抑制剂。
7、减少基因组dna污染
rt-pcr所遇到的一个潜在的困难是rna中有基因组dna污染，可以在逆转录之使用扩增的dnaseⅰ对rna进行处理以除去沾染的dna。将样品在2.0mm edta中65℃保温10分钟以终止dnaseⅰ消化。edta可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的dna水解。为了将扩增的cdna同沾染的基因组dna扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cdna的pcr产物会比来源于污染的基因组dna的产物短。另外对每个rna模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组dna还是cdna。在无逆转录时所得到的pcr产物来源于基因组。
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