基因工程实验报告的实验步骤
实验一：大肠杆菌dh5α和bl21感受态细胞的制备
【实验步骤】
1 从lb平板上挑取新活化的大肠杆菌dh5α单菌落，接种到5ml lb培养基中，37℃振荡培养过夜。
2 取1ml培养物接种到100ml lb培养基（250ml三角瓶）中，37℃振荡培养2~3h。 3 将菌液转移到50ml离心管（2管）中，冰上放置15min。 4 4℃ 4000 rpm 离心5min，弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5 用20 ml 冷cacl2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4℃ 4000 rpm 离心5min，弃去上清液。
6 用10 ml 冷cacl2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30min。
7 4℃ 4000 rpm 离心5min，弃去上清液，用2 ml的冷cacl2溶液悬浮。 8 分装到数个ep管中，每管200 ul，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（t-sod或t-il218）
和表达载体质粒（pet32或pet30）的转化及大量提取
【实验步骤】
一、载体的转化（无菌条件，冰上进行） 1、取200 ul 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒dna 2 ul（pet32a，il-18），混匀，冰上放置30min。
2、将ep管放到42℃ 保温90s，冰浴 2min。
3、加入800ul lb液体培养基，37℃慢摇复苏1 h。
4、将100 ul 的复苏细胞涂布在含有amp（100mg/ml）的lb培养皿中，正置平皿30min（使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37℃培养16 h，出现菌落。 二、质粒的提取
1 挑取单菌落接种于100 ml 加入50ul amp 的lb液体培养基中，振荡培养过夜。
2 过夜培养的菌液加入1.5 ml的小指管（20个每组）中，每次1 ml，4℃，12000 rpm，离心1min，4次，弃上清。
3 加入150ul溶液ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10min。
4 加入350ul溶液ⅱ（新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5min。（不能再剧烈震荡） 5 加入300ul溶液ⅲ（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10min。 6 4℃，12000 rpm，离心10 min，取上清转移至另一离心管中。 7 向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20 min。
8 4℃，12000 rpm，离心10 min，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9 用1ml 70%乙醇洗涤质粒dna沉淀2次，每次4℃，12000 rpm，离心3min，吸去上清。 10 55℃烘干至无酒精，加入20ul te，所有集成一管后加入rnase 1~2ul，37℃消化1~2h，-20℃保存。
11 电泳分析。制胶：0.14g琼脂糖，20ml 1×tbe缓冲液，溶解后倒入制胶板，放入梳子，冷却凝固待用。点样：6ul质粒+1ul上样缓冲液。电压：180v，电泳至蓝色带距离点样孔3cm
实验三 目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化
【实验步骤】
1 酶切
酶切体系
试剂 小量酶切 大量酶切
灭菌水 5ul —
质粒 10ul 88ul
ecorⅰ 0.5ul 1ul
hindⅲ 0.5ul 1ul
10×tango buffer 4ul 10ul
终体积 20ul 100ul
按以上酶切体系加入0.5 ml ep管中，37℃放置3h，电泳回收片段。 （点样：酶切体系100ul+上样缓冲液20ul。）
2 酶切产物的回收
1) 将单一的目的dna条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分放入干净的离心管中，
称取重量。
2) 向胶块中加入3倍体积溶胶液（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100ul，则加入300ul
溶胶液），50-55℃水浴放置10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
注意：溶胶时，如果溶胶液变为红色（正常情况下为淡黄色），可向含有dna的胶溶液中加10-30ul 3n醋酸钠（ph5.2）将溶液调为淡黄色，否则将会影响dna与吸附柱的结合，影响回收效果。
3) 将上一步所得的溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13，000rpm 离心
30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
注意：胶块*溶解后将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合dna的能力较弱。
4) 向吸附柱中加入700ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13，000rpm 离
心30-60s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
5) 向吸附柱中加入500ul漂洗液，13，000rpm 离心30-60s，倒掉废液。
6) 将离心吸附柱放回收集管中，13，000rpm 离心2min，尽量出去漂洗液，将吸附柱开盖
于室温1-2min，*晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
7) 将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃预热的洗
脱液，室温放置2min。13，000rpm 离心2min收集dna溶液。 8) dna产物-20℃保存。
完毕后电泳检测回收与纯化效果：dna回收纯化后，电泳检测应为单一的一条带，如果切胶过程中不慎带上染带，回收后电泳结果可能会出现两条以上的带，这时应重复上述方法进行回收与纯化。
实验四 目的基因与表达载体的重组及重组子的筛选与鉴定
【实验步骤】
1载体与目的基因的连接
1) 在一1.5ml ep管中加入2ul酶切后的载体dna与6ul目的dna片段。 2) 添加1ul的10×buffer以及1ul的t4dna连接酶，总体积10ul。 3) 16℃水浴条件下保温过夜连接。 2感受态细胞与连接产物的转化 1) 取感受态细胞bl21（实验一制备） 200ul，加入6ul连接产物，轻轻用枪吹打混匀（不
可震荡）。 2) 冰浴30min。
3) 热激：42℃保温90s，冰浴2min。
4) 加入800ul lb培养基，37℃慢慢复苏30min。
5) 将复苏菌液4000r/min离心1min，先吸去800μl上清，再将细胞吹散成细胞悬液，取
50μl细胞悬液直接涂布在含氨苄*（amp）100ug/ml、x-gal和iptg的lb选择平板上。
6) 将平板正向放置30min左右至液体被吸收，倒置平板37℃培养16—20h出现菌落，其
中白色为重组质粒。
3 重组子的鉴定（蓝白斑筛选，小提质粒比大小和酶切分析）
1）将白色单菌落接入3ml 含抗生素（amp）的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜。 2）按实验二的方法提取质粒dna，20ul rte溶解dna沉淀。 3）双酶切质粒dna 20ul 体系，方法同上。
4）1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物。
（酶切鉴定重组子可见重组成功的重组子有两个条带：一为切为线性的pet32a质粒条带，一为目的基因条带。）
实验五 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的sds-page分析
实验i 、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
【实验步骤】
1. 分别挑取白斑菌落（重组菌株）、蓝斑菌落（非重组菌株）于5ml 含amp的lb液体培养基中，37℃，190r/min振荡培养过夜(注意取菌株要在超静工作台上操作，一定注意无菌)。 2.分别取过夜培养菌1ml接种到5ml含amp的lb液体培养基中（蓝，白斑各3管，作好标记），于37℃摇床培养4h左右，达到1个od值。
3.因为诱导剂iptg的量,诱导条件,诱导时间，培养基成分都可影响诱导表达，所以可按如下6组设计培养
摇瓶时间（t/h） iptg/ul 温度t/℃ 样液
5 7 32 白
5 7 37 白
5 7 42 白
5 7 32 蓝
5 7 37 蓝
5 7 42 蓝
4.分别取 6支试管按上述表格控制条件,摇瓶培养5h。
5. 取1ml摇瓶后菌液于离心管，共6支，4℃低温离心，12000 r/min，5 min，收获菌体，弃上清，取沉淀（菌体可放-20℃存放备用）。
6.向每支试管沉淀均加入200μl te液，将细胞悬浮。
7. 每管加入200μl 2 x sds buffer。开水煮沸5min，再冰浴2min，4℃,12000 r/min，5 min，取上清液做凝胶电泳。
8.观测结果及分析（实验ⅱ）
实验ⅱ sds-page检测表达蛋白
【实验步骤】
1． 配制分离胶
分离胶配方
双蒸水 分离胶缓冲液 30%胶贮液 10%sds temed 10%ap
6.7ml 5ml 8ml 200μl 15μl 150μl
①按要求装好胶板 ②按比例调好分离胶，混匀后加入两玻璃夹缝中，到上口约2cm处，并小心在胶面上加入 1cm 蒸馏水，约 40 min，等胶自然凝聚后倾斜倒，出蒸馏水，并在两玻璃板夹缝中水平插入 1.5 mm 的梳子(在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶)。
2.按配方配制好浓缩胶
浓缩胶配方 双蒸水
浓缩胶缓冲
液 胶贮液 10%sds temed 10%ap 6.1ml 2.5ml 1.3ml 100μl 15μl 75μl
混匀后加入到分离胶上，并没过梳子，待凝固后小心拨出梳子。
3．样品制备
菌体样品与 2×上样缓冲液 l:1 混匀，并在 100c 沸水浴中保温 3-5 min，取出待用。
4.点样，电泳：开始电泳后，先恒压80v，样品进入分离胶后恒压120v，至电泳带跑到前沿后停止电泳。
5.固定、染色、脱色：电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶浸泡于染色液中染色30min左右，zui后加脱色液放到脱色摇床上脱色至区带清晰为止。
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1 从lb平板上挑取新活化的大肠杆菌dh5α单菌落，接种到5ml lb培养基中，37℃振荡培养过夜。
2 取1ml培养物接种到100ml lb培养基（250ml三角瓶）中，37℃振荡培养2~3h。 3 将菌液转移到50ml离心管（2管）中，冰上放置15min。 4 4℃ 4000 rpm 离心5min，弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5 用20 ml 冷cacl2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4℃ 4000 rpm 离心5min，弃去上清液。
6 用10 ml 冷cacl2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30min。
7 4℃ 4000 rpm 离心5min，弃去上清液，用2 ml的冷cacl2溶液悬浮。 8 分装到数个ep管中，每管200 ul，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（t-sod或t-il218）
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【实验步骤】
一、载体的转化（无菌条件，冰上进行） 1、取200 ul 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒dna 2 ul（pet32a，il-18），混匀，冰上放置30min。
2、将ep管放到42℃ 保温90s，冰浴 2min。
3、加入800ul lb液体培养基，37℃慢摇复苏1 h。
4、将100 ul 的复苏细胞涂布在含有amp（100mg/ml）的lb培养皿中，正置平皿30min（使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37℃培养16 h，出现菌落。 二、质粒的提取
1 挑取单菌落接种于100 ml 加入50ul amp 的lb液体培养基中，振荡培养过夜。
2 过夜培养的菌液加入1.5 ml的小指管（20个每组）中，每次1 ml，4℃，12000 rpm，离心1min，4次，弃上清。
3 加入150ul溶液ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10min。
4 加入350ul溶液ⅱ（新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5min。（不能再剧烈震荡） 5 加入300ul溶液ⅲ（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10min。 6 4℃，12000 rpm，离心10 min，取上清转移至另一离心管中。 7 向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20 min。
8 4℃，12000 rpm，离心10 min，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9 用1ml 70%乙醇洗涤质粒dna沉淀2次，每次4℃，12000 rpm，离心3min，吸去上清。 10 55℃烘干至无酒精，加入20ul te，所有集成一管后加入rnase 1~2ul，37℃消化1~2h，-20℃保存。
11 电泳分析。制胶：0.14g琼脂糖，20ml 1×tbe缓冲液，溶解后倒入制胶板，放入梳子，冷却凝固待用。点样：6ul质粒+1ul上样缓冲液。电压：180v，电泳至蓝色带距离点样孔3cm
实验三 目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化
【实验步骤】
1 酶切
酶切体系
试剂 小量酶切 大量酶切
灭菌水 5ul —
质粒 10ul 88ul
ecorⅰ 0.5ul 1ul
hindⅲ 0.5ul 1ul
10×tango buffer 4ul 10ul
终体积 20ul 100ul
按以上酶切体系加入0.5 ml ep管中，37℃放置3h，电泳回收片段。 （点样：酶切体系100ul+上样缓冲液20ul。）
2 酶切产物的回收
1) 将单一的目的dna条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分放入干净的离心管中，
称取重量。
2) 向胶块中加入3倍体积溶胶液（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100ul，则加入300ul
溶胶液），50-55℃水浴放置10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
注意：溶胶时，如果溶胶液变为红色（正常情况下为淡黄色），可向含有dna的胶溶液中加10-30ul 3n醋酸钠（ph5.2）将溶液调为淡黄色，否则将会影响dna与吸附柱的结合，影响回收效果。
3) 将上一步所得的溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13，000rpm 离心
30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
注意：胶块*溶解后将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合dna的能力较弱。
4) 向吸附柱中加入700ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13，000rpm 离
心30-60s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
5) 向吸附柱中加入500ul漂洗液，13，000rpm 离心30-60s，倒掉废液。
6) 将离心吸附柱放回收集管中，13，000rpm 离心2min，尽量出去漂洗液，将吸附柱开盖
于室温1-2min，*晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
7) 将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃预热的洗
脱液，室温放置2min。13，000rpm 离心2min收集dna溶液。 8) dna产物-20℃保存。
完毕后电泳检测回收与纯化效果：dna回收纯化后，电泳检测应为单一的一条带，如果切胶过程中不慎带上染带，回收后电泳结果可能会出现两条以上的带，这时应重复上述方法进行回收与纯化。
实验四 目的基因与表达载体的重组及重组子的筛选与鉴定
【实验步骤】
1载体与目的基因的连接
1) 在一1.5ml ep管中加入2ul酶切后的载体dna与6ul目的dna片段。 2) 添加1ul的10×buffer以及1ul的t4dna连接酶，总体积10ul。 3) 16℃水浴条件下保温过夜连接。 2感受态细胞与连接产物的转化 1) 取感受态细胞bl21（实验一制备） 200ul，加入6ul连接产物，轻轻用枪吹打混匀（不
可震荡）。 2) 冰浴30min。
3) 热激：42℃保温90s，冰浴2min。
4) 加入800ul lb培养基，37℃慢慢复苏30min。
5) 将复苏菌液4000r/min离心1min，先吸去800μl上清，再将细胞吹散成细胞悬液，取
50μl细胞悬液直接涂布在含氨苄*（amp）100ug/ml、x-gal和iptg的lb选择平板上。
6) 将平板正向放置30min左右至液体被吸收，倒置平板37℃培养16—20h出现菌落，其
中白色为重组质粒。
3 重组子的鉴定（蓝白斑筛选，小提质粒比大小和酶切分析）
1）将白色单菌落接入3ml 含抗生素（amp）的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜。 2）按实验二的方法提取质粒dna，20ul rte溶解dna沉淀。 3）双酶切质粒dna 20ul 体系，方法同上。
4）1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物。
（酶切鉴定重组子可见重组成功的重组子有两个条带：一为切为线性的pet32a质粒条带，一为目的基因条带。）
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【实验步骤】
1. 分别挑取白斑菌落（重组菌株）、蓝斑菌落（非重组菌株）于5ml 含amp的lb液体培养基中，37℃，190r/min振荡培养过夜(注意取菌株要在超静工作台上操作，一定注意无菌)。 2.分别取过夜培养菌1ml接种到5ml含amp的lb液体培养基中（蓝，白斑各3管，作好标记），于37℃摇床培养4h左右，达到1个od值。
3.因为诱导剂iptg的量,诱导条件,诱导时间，培养基成分都可影响诱导表达，所以可按如下6组设计培养
摇瓶时间（t/h） iptg/ul 温度t/℃ 样液
5 7 32 白
5 7 37 白
5 7 42 白
5 7 32 蓝
5 7 37 蓝
5 7 42 蓝
4.分别取 6支试管按上述表格控制条件,摇瓶培养5h。
5. 取1ml摇瓶后菌液于离心管，共6支，4℃低温离心，12000 r/min，5 min，收获菌体，弃上清，取沉淀（菌体可放-20℃存放备用）。
6.向每支试管沉淀均加入200μl te液，将细胞悬浮。
7. 每管加入200μl 2 x sds buffer。开水煮沸5min，再冰浴2min，4℃,12000 r/min，5 min，取上清液做凝胶电泳。
8.观测结果及分析（实验ⅱ）
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1． 配制分离胶
分离胶配方
双蒸水 分离胶缓冲液 30%胶贮液 10%sds temed 10%ap
6.7ml 5ml 8ml 200μl 15μl 150μl
①按要求装好胶板 ②按比例调好分离胶，混匀后加入两玻璃夹缝中，到上口约2cm处，并小心在胶面上加入 1cm 蒸馏水，约 40 min，等胶自然凝聚后倾斜倒，出蒸馏水，并在两玻璃板夹缝中水平插入 1.5 mm 的梳子(在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶)。
2.按配方配制好浓缩胶
浓缩胶配方 双蒸水
浓缩胶缓冲
液 胶贮液 10%sds temed 10%ap 6.1ml 2.5ml 1.3ml 100μl 15μl 75μl
混匀后加入到分离胶上，并没过梳子，待凝固后小心拨出梳子。
3．样品制备
菌体样品与 2×上样缓冲液 l:1 混匀，并在 100c 沸水浴中保温 3-5 min，取出待用。
4.点样，电泳：开始电泳后，先恒压80v，样品进入分离胶后恒压120v，至电泳带跑到前沿后停止电泳。
5.固定、染色、脱色：电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶浸泡于染色液中染色30min左右，zui后加脱色液放到脱色摇床上脱色至区带清晰为止。
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