原核表达实验流程
1.什么是原核表达
利用基因克隆技术，借助表达载体将外源目的基因转化至宿主细胞中，使其在原核生物体内稳定表达的方法叫做原核表达。
2.原核表达原理
2.1原核表达的基本构成
原核表达系统包括两个部分：表达载体和宿主细胞。
表达载体是一段重组dna分子，主要元件有启动子、筛选标签、多克隆位点、复制子、复制起点以及融合标签。启动子分强弱，并不是所有的基因都适用强启动子，有的基因在强启动子驱动下快速大量表达，常会造成其翻译产物不能正确进行折叠而形成不具有活性的包涵体。融合标签可以帮助蛋白表达及纯化，常见的融合标签有his，gst，ha，flag等。
宿主细胞是指能够实现目的基因转录、翻译以及合成目的蛋白的生命体，常见的原核表达宿主有大肠杆菌和枯草杆菌。
2.2原核表达的实验流程
（1）表达载体构建
表达载体的使用通常要根据所表达蛋白的用途、已知信息以及克隆和纯化策略来进行选择（卡梅德生物可以提供包含多种融合标签的表达载体，促进蛋白的可溶性，简化蛋白纯化过程，详情见公司网站）。选择好载体后可以通过同源重组或者无缝克隆的方法将目的基因构建到表达载体上。
（2）转化宿主细胞
宿主菌的选择要根据宿主菌和外源基因表达产物来确定，原核表达常用的宿主菌有大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性菌）。通常根据以下因素进行考虑：1.宿主菌内源酶是否会影所表达蛋白的稳定性，大肠杆菌通常会产生内毒素，而枯草芽孢杆菌不会产生内毒素；常见的bl21系列就是lon和ompt蛋白酶缺陷型菌株。2.宿主菌密码子的偏爱性，真核细胞和原核细胞的密码子偏爱性有所差别，当要表达真核基因时可以选择rosetta系列。3.所表达蛋白是否需要进行折叠，k-12衍生菌origami 2系列可以促进二硫键的形成，帮助蛋白进行正确的折叠，提高蛋白的的可溶性以及活性。选择好合适的宿主菌后，将含有目的基因的重组质粒转化至宿主菌细胞中，并进行阳性克隆的筛选。
卡梅隆收集与建立了包括低温诱导表达在内的多种菌株可供选择，如需进一步了解，请移步公司网站。
（3）目的蛋白的诱导表达
iptg诱导是常见的诱导方法。低浓度iptg（0.2-0.5mm），不会降低表达量，反而可以增加蛋白的可溶性。iptg浓度过高会加快蛋白表达速度，造成翻译产物不能进行正确折叠而产生包涵体。实验过程中需要不断优化iptg的更适浓度使目的蛋白达到个更适的活性和溶解性。此外培养的温度对蛋白的可溶性表达也存在一定影响，实验中也要不断探寻更适的温度和培养时间。
（4）目的蛋白的分离纯化
目的蛋白的分离纯化分为前处理、粗分离和细分离三个步骤。
前处理：对样品进行初步处理，将蛋白质从样品中释放出来并保持原来状态的过程。
粗分离：此步骤目的是通过盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法将目的蛋白进行纯化，与其他杂蛋白分离开来。
细分离：一般根据标签来选择相对应的纯化方法进行目的蛋白的进一步纯化。
（5）目的蛋白的检测
目的蛋白的检测可采用sds-page、western-blolt和elisa等方法。要注意的是为防止蛋白质变性所有操作都应在冰上进行。
图1原核表达流程图
3.融合标签及表达宿主类型
表1蛋白标签主要特征
肽标签
残基/mw（kda)
配体/基质
纯化条件
poly-arg
~5/0.80
阳离子交换树脂
nacl线性洗脱(0–400 mm)
poly-his
~6/0.84
ni2+琼脂柱
20–250 mm咪唑/低ph
flag
8/1.01
flag抗体亲和琼脂柱
2–5 mm edta
strep-tag ii
8/1.06
链亲和素
2–25 mm脱硫生物素
c-myc
11/1.20
myc抗体亲和琼脂柱
低ph
s-tag
15/1.75
s蛋白琼脂柱
3 m异硫氰酸; 0.2 m柠檬酸钾, ph 2或3 m mgcl2
融合伴侣蛋白
ca. (计算分子量)
配体/基质
纯化条件
fh8
69/8.0
ca2+依赖性苯基琼脂糖凝胶
10 mm edta
trx
109/11.7
4氨基氧化苯胂琼脂凝胶柱
5–1000mm c2h6os
sumo
ca. 100/12.0
亲和标签纯化（his）
brt17 (βroll tag)
153/14.7
25–75 mm ca2+溶液沉淀
gst
211/26.0
谷胱甘肽琼脂柱
10–20 mm还原谷胱甘肽
halotag7
ca. 300/34.0
氯烷烃配体琼脂柱
带标签挂柱蛋白酶裂解
mbp
396/ca. 42.5
交联支链淀粉
10 mm麦芽糖
elps
550/ca.47.0
高浓度nacl (>1.5 m)或温度转变方式
nusa
495/54.8
亲和标签纯化（his）
表2宿主体系选择
项目
大肠杆菌表达宿主
枯草杆菌表达宿主
优点
应用广泛，操作简单，大规模生产成本低廉
生产成本低廉，不产内毒素，能够分泌表达蛋白
缺点
分泌能力差
产量相对较低
常用宿主
rosetta (de3)，rosetta(de3)plyss，rosetta 2(de3)plyss，origami 2(de3)，rosetta-gami 2(de3)plyss
wb600，wb800n，bacillus subtilis 168
4.原核表达技术优势及缺点
优势：（1）遗传背景清楚。（2）高效：目的基因表达水平高、培养周期短。（3）操作简单，易于生长和控制。（4）成本低，适用于大规模生产。（5）可供选择的菌株及配套载体丰富。
缺点：（1）表达的蛋白未经修饰不一定具有活性（2）翻译产物常以包涵体形式表达。（3）会产生内毒素。
5.应用场景
原核表达广泛应用于抗体、疫苗、药物、动植物生长调节物质、抗虫蛋白等的研发与生产。此外，原核表达还凭借其高效、低成本的特点应用于工业酶、生物染料等生产过程。
6.卡梅德可以提供什么样的原核表达服务
卡梅德生物拥有完善的原核表达纯化体系，可以为客户提供多种表达载体和宿主菌株，可以提供给客户一个优质的表达策略，此外我们拥有丰富的纯化方式，以保证提供一个优质的纯化方案。客户仅需提供给我们一段蛋白序列，cds或蛋白名称，我们就可以在较短时间内为您完成目的蛋白的表达纯化，为您提供一站式服务，如需提供原核表达纯化帮助，请浏览卡梅德生物科技有限公司网站。
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2.原核表达原理
2.1原核表达的基本构成
原核表达系统包括两个部分：表达载体和宿主细胞。
表达载体是一段重组dna分子，主要元件有启动子、筛选标签、多克隆位点、复制子、复制起点以及融合标签。启动子分强弱，并不是所有的基因都适用强启动子，有的基因在强启动子驱动下快速大量表达，常会造成其翻译产物不能正确进行折叠而形成不具有活性的包涵体。融合标签可以帮助蛋白表达及纯化，常见的融合标签有his，gst，ha，flag等。
宿主细胞是指能够实现目的基因转录、翻译以及合成目的蛋白的生命体，常见的原核表达宿主有大肠杆菌和枯草杆菌。
2.2原核表达的实验流程
（1）表达载体构建
表达载体的使用通常要根据所表达蛋白的用途、已知信息以及克隆和纯化策略来进行选择（卡梅德生物可以提供包含多种融合标签的表达载体，促进蛋白的可溶性，简化蛋白纯化过程，详情见公司网站）。选择好载体后可以通过同源重组或者无缝克隆的方法将目的基因构建到表达载体上。
（2）转化宿主细胞
宿主菌的选择要根据宿主菌和外源基因表达产物来确定，原核表达常用的宿主菌有大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性菌）。通常根据以下因素进行考虑：1.宿主菌内源酶是否会影所表达蛋白的稳定性，大肠杆菌通常会产生内毒素，而枯草芽孢杆菌不会产生内毒素；常见的bl21系列就是lon和ompt蛋白酶缺陷型菌株。2.宿主菌密码子的偏爱性，真核细胞和原核细胞的密码子偏爱性有所差别，当要表达真核基因时可以选择rosetta系列。3.所表达蛋白是否需要进行折叠，k-12衍生菌origami 2系列可以促进二硫键的形成，帮助蛋白进行正确的折叠，提高蛋白的的可溶性以及活性。选择好合适的宿主菌后，将含有目的基因的重组质粒转化至宿主菌细胞中，并进行阳性克隆的筛选。
卡梅隆收集与建立了包括低温诱导表达在内的多种菌株可供选择，如需进一步了解，请移步公司网站。
（3）目的蛋白的诱导表达
iptg诱导是常见的诱导方法。低浓度iptg（0.2-0.5mm），不会降低表达量，反而可以增加蛋白的可溶性。iptg浓度过高会加快蛋白表达速度，造成翻译产物不能进行正确折叠而产生包涵体。实验过程中需要不断优化iptg的更适浓度使目的蛋白达到个更适的活性和溶解性。此外培养的温度对蛋白的可溶性表达也存在一定影响，实验中也要不断探寻更适的温度和培养时间。
（4）目的蛋白的分离纯化
目的蛋白的分离纯化分为前处理、粗分离和细分离三个步骤。
前处理：对样品进行初步处理，将蛋白质从样品中释放出来并保持原来状态的过程。
粗分离：此步骤目的是通过盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法将目的蛋白进行纯化，与其他杂蛋白分离开来。
细分离：一般根据标签来选择相对应的纯化方法进行目的蛋白的进一步纯化。
（5）目的蛋白的检测
目的蛋白的检测可采用sds-page、western-blolt和elisa等方法。要注意的是为防止蛋白质变性所有操作都应在冰上进行。
图1原核表达流程图
3.融合标签及表达宿主类型
表1蛋白标签主要特征
肽标签
残基/mw（kda)
配体/基质
纯化条件
poly-arg
~5/0.80
阳离子交换树脂
nacl线性洗脱(0–400 mm)
poly-his
~6/0.84
ni2+琼脂柱
20–250 mm咪唑/低ph
flag
8/1.01
flag抗体亲和琼脂柱
2–5 mm edta
strep-tag ii
8/1.06
链亲和素
2–25 mm脱硫生物素
c-myc
11/1.20
myc抗体亲和琼脂柱
低ph
s-tag
15/1.75
s蛋白琼脂柱
3 m异硫氰酸; 0.2 m柠檬酸钾, ph 2或3 m mgcl2
融合伴侣蛋白
ca. (计算分子量)
配体/基质
纯化条件
fh8
69/8.0
ca2+依赖性苯基琼脂糖凝胶
10 mm edta
trx
109/11.7
4氨基氧化苯胂琼脂凝胶柱
5–1000mm c2h6os
sumo
ca. 100/12.0
亲和标签纯化（his）
brt17 (βroll tag)
153/14.7
25–75 mm ca2+溶液沉淀
gst
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10–20 mm还原谷胱甘肽
halotag7
ca. 300/34.0
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mbp
396/ca. 42.5
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10 mm麦芽糖
elps
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nusa
495/54.8
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表2宿主体系选择
项目
大肠杆菌表达宿主
枯草杆菌表达宿主
优点
应用广泛，操作简单，大规模生产成本低廉
生产成本低廉，不产内毒素，能够分泌表达蛋白
缺点
分泌能力差
产量相对较低
常用宿主
rosetta (de3)，rosetta(de3)plyss，rosetta 2(de3)plyss，origami 2(de3)，rosetta-gami 2(de3)plyss
wb600，wb800n，bacillus subtilis 168
4.原核表达技术优势及缺点
优势：（1）遗传背景清楚。（2）高效：目的基因表达水平高、培养周期短。（3）操作简单，易于生长和控制。（4）成本低，适用于大规模生产。（5）可供选择的菌株及配套载体丰富。
缺点：（1）表达的蛋白未经修饰不一定具有活性（2）翻译产物常以包涵体形式表达。（3）会产生内毒素。
5.应用场景
原核表达广泛应用于抗体、疫苗、药物、动植物生长调节物质、抗虫蛋白等的研发与生产。此外，原核表达还凭借其高效、低成本的特点应用于工业酶、生物染料等生产过程。
6.卡梅德可以提供什么样的原核表达服务
卡梅德生物拥有完善的原核表达纯化体系，可以为客户提供多种表达载体和宿主菌株，可以提供给客户一个优质的表达策略，此外我们拥有丰富的纯化方式，以保证提供一个优质的纯化方案。客户仅需提供给我们一段蛋白序列，cds或蛋白名称，我们就可以在较短时间内为您完成目的蛋白的表达纯化，为您提供一站式服务，如需提供原核表达纯化帮助，请浏览卡梅德生物科技有限公司网站。
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