小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法
海马体主要负责记忆和学习，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起，由细胞体和细胞突起构成。
小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。
1.试验所需仪器设备及试剂
（1）仪器
生物安全柜
co2细胞培养箱
荧光倒置显微镜
高速冷冻离心机
电热恒温鼓风干燥箱
（2）试剂耗材
t25细胞培养瓶
血球计数板
细胞培养孔板
红细胞裂解液
神经元*培养基
0.25%胰蛋白酶（含0.02%edta）
多聚甲醛（pfa）
dapi
triton x-100
山羊血清
nse
goat anti-rabbit lgg（h+l）
cross-adsorbed secondary antibody，alexa fluor 594
fluoromount-g荧光封片剂
2.分离培养方法
1)取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，
2)在冰浴的pbs中分离海马，pbs洗涤3次，剪碎，
3)用0.25%trypsin+0.1%ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，
4)用fbs终止消化，轻轻吹打，
5)过100 μm 滤网，
6)收集滤液，300 g离心5min，
7)用*培养基重悬沉淀，铺瓶。
3.免疫荧光
3.1.实验步骤
（1）细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1ml，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
（2）固定
细胞爬片后，吸出培养基，用pbs洗1遍，加入4% pfa于4℃固定30min。用pbs洗3×5min/次。也可最后一次不吸出pbs，放4℃过夜。
（3）破膜封闭
将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，
玻璃片封闭液配置：0.5% trition x-100与pbs 1:1混合，再加10% 血清，
取50ul破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗体与pbs 1:100（200）稀释
破膜封闭后，取50ul一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）
（5）二抗孵育
室温避光孵育二抗（二抗:pbs=1:500）2h后，pbs洗3×5min/次，染dapi（dapi:pbs=1:1000）5min，pbs洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴fluoromount-g，将有细胞的一面盖上。
鉴定细胞为p1代细胞
3.2.检测结果 （1）细胞免疫荧光鉴定照片
阴性
100x-dapi 100x-fluorescence
nse
100x-dapi 100x-fluorescence
（2）检验基本情况：
经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达到90%以上。
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3)用0.25%trypsin+0.1%ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，
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6)收集滤液，300 g离心5min，
7)用*培养基重悬沉淀，铺瓶。
3.免疫荧光
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（1）细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1ml，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
（2）固定
细胞爬片后，吸出培养基，用pbs洗1遍，加入4% pfa于4℃固定30min。用pbs洗3×5min/次。也可最后一次不吸出pbs，放4℃过夜。
（3）破膜封闭
将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，
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取50ul破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。
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室温避光孵育二抗（二抗:pbs=1:500）2h后，pbs洗3×5min/次，染dapi（dapi:pbs=1:1000）5min，pbs洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴fluoromount-g，将有细胞的一面盖上。
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阴性
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