人脑类器官培养手册
研究背景越来越多的神经类疾病未被攻克，威胁着人类的健康，所以认识大脑的全部功能并能治疗各种神经类疾病是每个神经类科研工作者致力的方向。涉及现实和伦理方面的限制，想要获取实验使用的脑组织存在困难，传统上常使用某些多如啮齿类动物作为模式生物，用于神经科学的研究。但是，人和啮齿类动物的脑组织结构和发育相似度并不是很高，因此在体外培养脑类器官是一件非常急需解决的问题。
科研人员可以通过分化人多能干细胞（hpscs），包括诱导多能干细胞（ips）和胚胎干细胞（es），来获取神经细胞，在体外模拟人的环境，培养出脑类器官，有利于研究者发展治疗手段，从而治愈疾病。
培养方案文献一
研究团队开发了一种将人类多能干细胞分化为表达人类中脑特征标志物的神经元细胞层的方法，将患者的皮肤成纤维细胞重编程为ipscs，然后置于添加fgf-basic（碱性成纤维细胞因子）、chir-99021，mek抑制剂（pd0325901）的培养基中培养。
dmem/f12的神经元诱导培养基：神经基础、1：100n2、1：50b27去除维生素a、1%谷氨酰胺、10 μmsb-431542、200 ng/mlnoggin、0.8 μmchir-99021和10 μm rock抑制剂y-27632、0.1% β-巯基乙醇、1 μg/ml肝素。前48 h加入y-27632，第2天改变神经元诱导培养基。
3天后，hmlos开始挤压神经外胚层芽。此时，培养基被移除，并立即使用配备预冷200 μl移液管的移液管向每个孔中加入30 μl还原生长因子基质凝胶。将基质嵌入的中脑类器官放入37°c培养箱30 min，使基质凝固。
生长在组织生长诱导培养基中含有神经基础培养基，1：100n2、1：50b27去除维生素a、1%谷氨酰胺、0.1% β巯基乙醇、2.5 μg/ml胰岛素、200 ng/ml层粘连蛋白、100 ng/ml shh-c25ii和100 ng/ml fgf8。
分化培养基，包括神经基础培养基、1：100n2、1：50b27去除维生素a、1%谷氨酰胺、100 μm抗坏血酸、125 μmdbcamp、0.1% β巯基乙醇、10 ng/ml bdnf，10 ng/mlgdnf。培养基中加入了双抗，以防止长期培养过程中潜在的细菌污染。每3天更换一次培养基。[1]
图1.人中脑样类器官每个阶段细胞的典型形态（sbnc：sb-431542、chir-99021、noggin）[1]
图2.神经元免疫染色[1]
文献二
额颞叶痴呆是一种非常严重的神经系统疾病，会导致患者的行为、言语和思考出现问题。已知tau蛋白的突变和该疾病息息相关，但是具体的作用机制并不十分清楚。因此，研究团队利用人源诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，ipsc）在体外构建了额颞叶痴呆的大部分损伤的大脑类器官模型，表达tau突变蛋白，从而揭示神经元损伤的早期的分子水平变化，阐述致病机理，并发现一种药物apilimod能抑制神经元的死亡。
球形形成培养基（sfm）：e8培养基和10 mm rock抑制剂y-27632组成。
分化培养基由e6培养基添加2.5 mmdorsomorphin、10 mmsb-431542和2.5 mmxav-939；每个球状体添加1 ml培养基。将球状体轻轻混合，在37℃和5%二氧化碳下孵育48小时。
每天从培养皿中轻轻吸出培养基，用分化培养基替换，从第2天到第5天实现65%培养基交换。第6天，将培养基改为神经培养基（nm），包括神经基底、b27去除维生素a、谷氨酸和抗a，并添加20 ng/mlegf+20 ng/ml fgf2。
第25天，每隔一天用nm补充20 ng/ml bdnf和20 ng/ml nt3（培养基c），补充65%培养基。从第43天开始，每3-4天更换一次培养基，不添加生长因子，每个培养皿更换15-20 ml，75%培养基更换。在整个培养期间，融合在一起的类器官被一次性手术刀切割分开。在下图的实验中，诱导多能干细胞被生长和模式化。[2]
图3.脑类器官中神经元存活的纵向轴[2]
图4. 5 mm谷氨酸处理tau-v337m和等位基因v337v类器官图像[2]
图5.5 mm谷氨酸盐和dmso处理tau-v337m类器官图像[2]
图6.apilimod可逆转tau-v337m类器官对谷氨酸兴奋毒性的敏感性[2]
文献三
人类大脑发育表现出几个的方面，如复杂性的增加和神经元输出的扩大，已被证明很难在模式生物中进行研究。因此，体外方法模拟人类大脑发育和疾病是一个热门的研究领域。
在这里，研究团队建立了类脑器官培养模型，能模仿内源性发育程序，该模型能在标准组织培养室内进行培养，在1~2个月内即可发育出大脑皮层、腹侧端脑、视网膜等。这个方案可以应用于发育研究以及各种人类大脑疾病的研究。
此外，由于类器官可以在长期培养中维持一年以上，它们也有可能模拟后期事件，如神经元成熟和存活。
人多能干细胞产生大脑类器官：添加l-alanyl-l-glutamine solution、rock抑制剂y-27632、n-2 supplement、b27去除维生素a、b27+vita supplement、penicillin-streptomycin、bfgf等。[3]
图7.人pscs脑类器官发育的进展[3]
脑类器官培养添加的化合物汇总：
化合物名称
货号
规格
l-glutamine
60314es
100 g
b-27 supplement without vitamin a
60704es
10 ml
b-27 supplement,serum free,50x
60703es
10 ml
n-2 supplement
60706es
5 ml
l-alanyl-l-glutamine solution,200mm
60701es
100 ml/1 l
mem 非必需氨基酸溶液（neaa），100x
60707es
100 ml
penicillin-streptomycin
60162es
100 ml
sb-431542
53004es
5/10/50 mg
xav-939
52904es
10/25 mg
y-27632
53006es
1/5/10 mg
y-27632 dihydrochloride
52604es
5/10/25 mg
chir-99021
53003es
2/5/10 mg
dorsomorphin (compound c)
53593es
5/25 mg
pd0325901(mirdametinib)
53011es
5/10/50 mg
l-ascorbic acid l-抗坏血酸
53614es
1/5 g
dbcamp
53303es
50/100 mg
nimodipine
53762es
100/500 mg
mk-801 maleate
54013es
10/50 mg
apilimod a
54012es
5/25 mg
cnqx
54014es
5/25 mg
l-glutamic acid monosodium salt hydrate
54015es
100 mg
human bdnf
92129es
5/20/100/500 μg/1 mg
参考文献
[1] jo j, et al. midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. cell stem cell. 2016 aug 4;19(2):248-257. doi: 10.1016/j.stem.2016.07.005. epub 2016 jul 28. pmid: 27476966; pmcid: pmc5510242.
[2] bowles k r, et al. elavl4, splicing, and glutamatergic dysfunction precede neuron loss in mapt mutation cerebral organoids[j]. cell, 2021(suppl 5).
[3] lancaster m a, knoblich j a. generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells[j]. nature protocols erecipes for researchers, 2014.
为什么自由半浮球式疏水阀寿命长
助力打好“净土保卫战”！江苏省土壤污染防治条例将于9月1日起施行
磁翻板液位计进行水箱液位测量
薄层色谱的原理与应用
影像测量仪对元器件检测的应用
人脑类器官培养手册
蔡司三坐标测量机-医疗器械中的“测量专家”
人高半胱氨酸(Hcy）ELISA试剂盒课题研究
浅析铣端面打中心孔加工过程和原理
化工隔膜泵为化工领域的发展和进步提供了有力的支持
探索细胞景观：释放西北地区全景成像扫描仪的力量
小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法
气体腰轮流量计产品特点
给煤机布置在原煤斗与磨煤机之间
轴类光学测量仪提供全面的测量方案
低温试验箱试验注意事项
滗水器的特点及工作原理
沈阳一机CAK80135数控车床价格受数控车床数据备份的影响
淋巴细胞分离液可以分离哪些细胞？
GB/T 8947-1998编织袋的拉伸性能|编织袋拉力试验机 编织袋拉力测试机
科研人员可以通过分化人多能干细胞（hpscs），包括诱导多能干细胞（ips）和胚胎干细胞（es），来获取神经细胞，在体外模拟人的环境，培养出脑类器官，有利于研究者发展治疗手段，从而治愈疾病。
培养方案文献一
研究团队开发了一种将人类多能干细胞分化为表达人类中脑特征标志物的神经元细胞层的方法，将患者的皮肤成纤维细胞重编程为ipscs，然后置于添加fgf-basic（碱性成纤维细胞因子）、chir-99021，mek抑制剂（pd0325901）的培养基中培养。
dmem/f12的神经元诱导培养基：神经基础、1：100n2、1：50b27去除维生素a、1%谷氨酰胺、10 μmsb-431542、200 ng/mlnoggin、0.8 μmchir-99021和10 μm rock抑制剂y-27632、0.1% β-巯基乙醇、1 μg/ml肝素。前48 h加入y-27632，第2天改变神经元诱导培养基。
3天后，hmlos开始挤压神经外胚层芽。此时，培养基被移除，并立即使用配备预冷200 μl移液管的移液管向每个孔中加入30 μl还原生长因子基质凝胶。将基质嵌入的中脑类器官放入37°c培养箱30 min，使基质凝固。
生长在组织生长诱导培养基中含有神经基础培养基，1：100n2、1：50b27去除维生素a、1%谷氨酰胺、0.1% β巯基乙醇、2.5 μg/ml胰岛素、200 ng/ml层粘连蛋白、100 ng/ml shh-c25ii和100 ng/ml fgf8。
分化培养基，包括神经基础培养基、1：100n2、1：50b27去除维生素a、1%谷氨酰胺、100 μm抗坏血酸、125 μmdbcamp、0.1% β巯基乙醇、10 ng/ml bdnf，10 ng/mlgdnf。培养基中加入了双抗，以防止长期培养过程中潜在的细菌污染。每3天更换一次培养基。[1]
图1.人中脑样类器官每个阶段细胞的典型形态（sbnc：sb-431542、chir-99021、noggin）[1]
图2.神经元免疫染色[1]
文献二
额颞叶痴呆是一种非常严重的神经系统疾病，会导致患者的行为、言语和思考出现问题。已知tau蛋白的突变和该疾病息息相关，但是具体的作用机制并不十分清楚。因此，研究团队利用人源诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，ipsc）在体外构建了额颞叶痴呆的大部分损伤的大脑类器官模型，表达tau突变蛋白，从而揭示神经元损伤的早期的分子水平变化，阐述致病机理，并发现一种药物apilimod能抑制神经元的死亡。
球形形成培养基（sfm）：e8培养基和10 mm rock抑制剂y-27632组成。
分化培养基由e6培养基添加2.5 mmdorsomorphin、10 mmsb-431542和2.5 mmxav-939；每个球状体添加1 ml培养基。将球状体轻轻混合，在37℃和5%二氧化碳下孵育48小时。
每天从培养皿中轻轻吸出培养基，用分化培养基替换，从第2天到第5天实现65%培养基交换。第6天，将培养基改为神经培养基（nm），包括神经基底、b27去除维生素a、谷氨酸和抗a，并添加20 ng/mlegf+20 ng/ml fgf2。
第25天，每隔一天用nm补充20 ng/ml bdnf和20 ng/ml nt3（培养基c），补充65%培养基。从第43天开始，每3-4天更换一次培养基，不添加生长因子，每个培养皿更换15-20 ml，75%培养基更换。在整个培养期间，融合在一起的类器官被一次性手术刀切割分开。在下图的实验中，诱导多能干细胞被生长和模式化。[2]
图3.脑类器官中神经元存活的纵向轴[2]
图4. 5 mm谷氨酸处理tau-v337m和等位基因v337v类器官图像[2]
图5.5 mm谷氨酸盐和dmso处理tau-v337m类器官图像[2]
图6.apilimod可逆转tau-v337m类器官对谷氨酸兴奋毒性的敏感性[2]
文献三
人类大脑发育表现出几个的方面，如复杂性的增加和神经元输出的扩大，已被证明很难在模式生物中进行研究。因此，体外方法模拟人类大脑发育和疾病是一个热门的研究领域。
在这里，研究团队建立了类脑器官培养模型，能模仿内源性发育程序，该模型能在标准组织培养室内进行培养，在1~2个月内即可发育出大脑皮层、腹侧端脑、视网膜等。这个方案可以应用于发育研究以及各种人类大脑疾病的研究。
此外，由于类器官可以在长期培养中维持一年以上，它们也有可能模拟后期事件，如神经元成熟和存活。
人多能干细胞产生大脑类器官：添加l-alanyl-l-glutamine solution、rock抑制剂y-27632、n-2 supplement、b27去除维生素a、b27+vita supplement、penicillin-streptomycin、bfgf等。[3]
图7.人pscs脑类器官发育的进展[3]
脑类器官培养添加的化合物汇总：
化合物名称
货号
规格
l-glutamine
60314es
100 g
b-27 supplement without vitamin a
60704es
10 ml
b-27 supplement,serum free,50x
60703es
10 ml
n-2 supplement
60706es
5 ml
l-alanyl-l-glutamine solution,200mm
60701es
100 ml/1 l
mem 非必需氨基酸溶液（neaa），100x
60707es
100 ml
penicillin-streptomycin
60162es
100 ml
sb-431542
53004es
5/10/50 mg
xav-939
52904es
10/25 mg
y-27632
53006es
1/5/10 mg
y-27632 dihydrochloride
52604es
5/10/25 mg
chir-99021
53003es
2/5/10 mg
dorsomorphin (compound c)
53593es
5/25 mg
pd0325901(mirdametinib)
53011es
5/10/50 mg
l-ascorbic acid l-抗坏血酸
53614es
1/5 g
dbcamp
53303es
50/100 mg
nimodipine
53762es
100/500 mg
mk-801 maleate
54013es
10/50 mg
apilimod a
54012es
5/25 mg
cnqx
54014es
5/25 mg
l-glutamic acid monosodium salt hydrate
54015es
100 mg
human bdnf
92129es
5/20/100/500 μg/1 mg
参考文献
[1] jo j, et al. midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. cell stem cell. 2016 aug 4;19(2):248-257. doi: 10.1016/j.stem.2016.07.005. epub 2016 jul 28. pmid: 27476966; pmcid: pmc5510242.
[2] bowles k r, et al. elavl4, splicing, and glutamatergic dysfunction precede neuron loss in mapt mutation cerebral organoids[j]. cell, 2021(suppl 5).
[3] lancaster m a, knoblich j a. generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells[j]. nature protocols erecipes for researchers, 2014.
为什么自由半浮球式疏水阀寿命长
助力打好“净土保卫战”！江苏省土壤污染防治条例将于9月1日起施行
磁翻板液位计进行水箱液位测量
薄层色谱的原理与应用
影像测量仪对元器件检测的应用
人脑类器官培养手册
蔡司三坐标测量机-医疗器械中的“测量专家”
人高半胱氨酸(Hcy）ELISA试剂盒课题研究
浅析铣端面打中心孔加工过程和原理
化工隔膜泵为化工领域的发展和进步提供了有力的支持
探索细胞景观：释放西北地区全景成像扫描仪的力量
小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法
气体腰轮流量计产品特点
给煤机布置在原煤斗与磨煤机之间
轴类光学测量仪提供全面的测量方案
低温试验箱试验注意事项
滗水器的特点及工作原理
沈阳一机CAK80135数控车床价格受数控车床数据备份的影响
淋巴细胞分离液可以分离哪些细胞？
GB/T 8947-1998编织袋的拉伸性能|编织袋拉力试验机 编织袋拉力测试机