GB 5009.206-2016 水产品中河豚毒素的测定
中华人民共和国国家标准
gb 5009.206-2016
食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定
前 言
本标准代替gb/t 23217-2008《水产品中河豚毒素的测定 液相色谱-荧光检测法》、gb/t 5009.206-2007《鲜河豚鱼中河豚毒素的测定》和sn/t 1569.2-2013《出口河豚鱼中河豚毒素检测方法 第2部分：小鼠生物法》。
本标准与gb/t 5009.206-2007相比，主要变化如下：
——标准名称修改为“食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定”；
——增加了净化步骤；
——修改了酶联免疫吸附法。
1 范围
本标准规定了水产品中河豚毒素的测定方法。
本标准第一法适用于河豚鱼肌肉、肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定。第二法适用于河豚鱼肌肉、肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定。第三法适用于河豚鱼、织纹螺、虾、牡蛎、花蛤和鱿鱼中河豚毒素的测定。第四法适用于河豚鱼肌肉、肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定。
第一法 小鼠生物法
2 原理
根据河豚毒素易溶于酸性溶液原理，试样制备后经两次乙酸溶液(0.5%)煮沸提取，20000g离心收集上清液，将两次上清液合并定容至25ml，用于小鼠生物试验。根据小鼠注射试样提取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重校正鼠单位，计算确定河豚毒素含量。
3 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为gb6682规定的三级水。
3.1 试剂
3.1.1 冰乙酸(ch3cooh)。
3.1.2 氢氧化钠(naoh)。
3.2 试剂配制
3.2.1 乙酸溶液(0.5%)：将5ml冰乙酸用水稀释至1l。
3.2.2 氢氧化钠溶液(1mol/l)：将40g氢氧化钠用水溶解并定容至1000ml。
3.3 标准品
河豚毒素(c11h17n3o8，cas号：4368-28-9)，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4 实验动物
小白鼠：体重19.0g~21.0g，无特定病原体级(spf)昆明系雄性健康小鼠。
4 仪器和设备
4.1 均质器：≥12000r/min。
4.2 电子天平：感量0.1g。
4.3 离心机：离心力≥30000g。
4.4 秒表。
5 分析步骤
注：为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作。移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在氢氧化钠溶液
(1mol/l)中浸泡1h以上，以使毒素分解。
5.1 试样制备
5.1.1 冷冻河豚鱼样品
将样品装于密封塑料袋内于自来水水流下快速解冻。解冻后用水洗净，用滤纸吸干，分解成肌肉、肝脏、皮肤等部分。分别称量后将各组织剪碎，充分均质。
5.1.2 新鲜河豚鱼样品
将样品用水洗净后用滤纸吸干，分解成肌肉、肝脏、皮肤等部分，分别称量后将各组织剪碎，充分均质。
5.2 试样提取
5.2.1 肌肉组织试样
准确称取试样10g(精确至0.1g)于50ml离心管中，加入乙酸溶液(0.5%)11ml，充分混匀，沸水浴中煮沸10min，不断搅拌以防止组织结块。冷却至室温，20000g 高速离心20min，移取上清液于25ml容量瓶中。向沉淀中加入乙酸溶液(0.5%)11ml，充分混匀，沸水浴中煮沸5min，不断搅拌以防止组织结块。冷却至室温，20000g 高速离心20min，移取上清液。合并上清液，混匀，用乙酸溶液(0.5%)定容至25ml。此提取液1ml相当于0.4g试样。
5.2.2 肝脏组织试样
准确称取10g(精确至0.1g)试样于50ml离心管中，加入乙酸溶液(0.5%)8ml，充分混匀，室温下20000g 高速离心20min，移取上清液于25ml容量瓶中。用8ml 乙酸溶液(0.5%)重复提取1次。合并上清液，混匀，用乙酸溶液(0.5%)定容至25ml。此提取液1ml相当于0.4g试样。
5.2.3 皮肤组织试样
准确称取10g(精确至0.1g)试样于50ml离心管中，加入乙酸溶液(0.5%)11ml，充分混匀，室温下20000g 高速离心20min，移取上清液于25ml容量瓶中。用11ml乙酸溶液(0.5%)重复提取1次。合并上清液，用乙酸溶液(0.5%)定容至25ml。此提取液1ml相当于0.4g试样。
注1：试样制备时，冷冻样品需在半解冻状态下进行操作。试样若不能及时检验，应于4℃保存，在24h内检验。
注2：如果河豚鱼样品的脏器或者组织不足10g的情况下，按照以上方法进行提取操作，需适量减少乙酸溶液(0.5%)的加入量。
注3：提取液中应不含有离心分离液表面上被分离出来的油状物、胶状物或者脂质类。
5.3 小鼠试验
选取19.0g~21.0g的无特定病原体级(spf)昆明系雄性健康小鼠6只，称量并记录体重。随机分为实验组和空白对照组两组，每组3只。对每只试验小鼠腹腔注射1 ml 试样提取液或乙酸溶液(0.5%)(空白对照液)。若注射过程中注射液溢出，须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。记录注射开始和完毕时间，仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间(到小鼠呼出最后一口气止)。
若注射试样提取液后，小鼠死亡时间小于7min，则按附录a 中表a.1计算出1ml试样提取液的毒力，以此为基准，配制出使小鼠在7min~13min死亡所需的稀释液，采用乙酸溶液(0.5%)进行稀释，将稀释液再注射至少3只小鼠以确定试样的毒力。具体示例见附录b。若注射试样溶液后，小鼠的死亡时间大于或等于7min，则直接根据中位数致死时间确定试样的毒力。
小鼠中毒死亡症状：被注射了河豚毒素的小鼠初期安静，随后出现呼吸困难，急促，腹部收缩加快，反应迟钝，继而出现突然疾走，急跑急跳，四处乱窜，东倒西歪，翻转乱跳等挣扎动作，数十秒后，小鼠后腿剧烈抽搐，2~3次后爬卧不动，腹部呼吸逐渐微弱减慢，最后死亡。以停止呼吸作为判断死亡的标准。
6 分析结果的表述
6.1 毒力的计算
根据小鼠试验中得到的小鼠致死时间，计算出中位数致死时间，然后按表a.1计算出毒力(若中位数致死时间刚好处于表a.1中给出的两时间中间时，则取两时间中较大的时间值；若介于表a.1中给出的两时间中但不正好处于中间时，则取更接近于中位数致死时间的时间值)。若小鼠体重不正好为20.0g，则按表a.2对鼠单位(mu)进行校正，通过校正后的鼠单位表示出提取液的毒力。
1mu 的定义为使体重为20.0g的无特定病原体级(spf)昆明系雄性小鼠30min死亡的毒力，相当于0.18μg河豚毒素。
试样中河豚毒素的含量按式(1)计算：
式中：
x ——试样中河豚毒素的含量，单位为鼠单位每克(mu/g)；
m ——1ml注射液的鼠单位数，单位为鼠单位(mu)；
e ——提取系数，本方法提取系数为3.11；
f ——试样提取液的稀释倍数；
w ——小鼠体重校正系数。
6.2 结果报告
在空白对照组小鼠正常的情况下，河豚鱼各组织中河豚毒素含量进行如下判断和表述：
若小鼠的死亡时间大于30min，结果报告为<3.11mu/g肌肉组织/肝脏/皮肤。
若小鼠的死亡时间小于30min，结果按式(1)计算得到实际结果报告，待测样品中河豚毒素含量为××× mu/g肌肉组织/肝脏/皮肤。
若3只小鼠死亡时间不都小于30min或不都大于30min，则需重新注射3只小鼠，以确保3只小鼠死亡时间都小于30min或都大于30min，结果据此判定；若重复注射3只小鼠死亡时间仍出现第一次小鼠死亡情况，则需根据第一次注射3只小鼠的中位数致死时间判定结果。
7 其他
本方法的检出限为3.11mu/g。
第二法 液相色谱-串联质谱法
8 原理
试样经1%乙酸-甲醇溶液提取，免疫亲和柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。
9 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为gb 6682规定的一级水。
9.1 试剂
9.1.1 甲醇(ch3oh)：色谱纯。
9.1.2 乙腈(ch3cn)：色谱纯。
9.1.3 甲酸(hcooh)：色谱纯。
9.1.4 冰乙酸(ch3cooh)：优级纯。
9.1.5 乙酸铵(ch3coonh4)：色谱纯。
9.1.6 十二水合磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)。
9.1.7 二水合磷酸二氢钠(nah2po4·2h2o)。
9.1.8 氯化钠(nacl)。
9.1.9 氢氧化钠(naoh)。
9.2 试剂配制
9.2.1 乙酸-甲醇溶液(1+99)：将冰乙酸和甲醇按1比99的体积比混合均匀。
9.2.2 乙酸-甲醇溶液(2+98)：将冰乙酸和甲醇按2比98的体积比混合均匀。
9.2.3 甲酸溶液(1+999)：将1ml甲酸加入到999ml水中，混匀。
9.2.4 含5mmol/l乙酸铵的0.1%甲酸溶液：称取0.19g乙酸铵，加入0.1%甲酸溶液定容至500ml。
9.2.5 甲酸溶液(0.1%)-乙腈溶液(1+1)：甲酸溶液(0.1%)与乙腈等体积混合均匀。
9.2.6 磷酸盐缓冲溶液(pbs溶液)：称取十二水合磷酸氢二钠6.45g、二水合磷酸二氢钠1.09g、氯化钠4.25g，用水溶解并定容至500ml。
9.2.7 氢氧化钠溶液(1mol/l)：准确称取20.0g氢氧化钠，用水溶解并定容至500ml。
9.3 标准品
河豚毒素(c11h17n3o8，cas号：4368-28-9)，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
9.4 标准溶液配制
9.4.1 河豚毒素标准储备液(100μg/ml)：准确称取河豚毒素标准品10mg(精确至0.1mg)，用少量甲酸溶液(0.1%)溶解，以甲醇定容至100ml，-18℃以下避光保存。
9.4.2 河豚毒素标准中间液(1μg/ml)：准确量取河豚毒素标准储备液(100μg/ml)适量，以甲酸溶液(0.1%)-乙腈溶液(1+1)稀释并定容，配制成1μg/ml的标准中间液，-18℃以下避光保存。
9.4.3 河豚毒素标准系列工作液：准确吸取河豚毒素标准中间液(1μg/ml)适量，以甲酸溶液(0.1%)-乙腈溶液(1+1)稀释并定容，得到浓度为1μg/l~1000μg/l的标准系列工作液，现用现配。
9.5 材料
9.5.1 河豚毒素免疫亲和柱：柱规格3ml，最大柱容量1000ng，或等效柱。
9.5.2 0.22μm 有机相微孔滤膜。
10 仪器和设备
10.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
10.2 分析天平：感量为0.1mg和0.01g。
10.3 均质机：≥12000r/min。
10.4 涡旋振荡器。
10.5 高速冷冻离心机：转速≥8000r/min。
10.6 固相萃取装置。
10.7 氮吹仪。
11 分析步骤
注：为避免毒素的危害，应戴手套进行操作。移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在氢氧化钠溶液(1mol/l)中浸泡1h以上，以使毒素分解。
11.1 试样制备
用水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、皮肤和性腺(精巢或卵巢)等部分，各部分组织分别用水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后将各组织剪碎，充分均质，装入清洁容器内，并标明标记。
11.2 试样提取
称取5g(精确到0.01g)匀浆试样于50ml具塞离心管中，加入11ml乙酸-甲醇溶液(1+99)，涡旋振荡2min，50℃水浴超声提取15min，以8000r/min离心5min，转移上清液于25ml容量瓶中。
向残渣中加入11ml乙酸-甲醇溶液(1+99)，重复提取一次，合并上清液，用乙酸-甲醇溶液(1+99)定容至25ml。移取约10ml提取液至另一50ml具塞离心管中，-20℃冷冻30min，再以8000r/min离心5min，准确移取5ml上清液，加入20mlpbs溶液进行稀释，用氢氧化钠溶液(1mol/l)调ph 在7~8范围内，待净化。
11.3 试样净化
将免疫亲和柱中封存的pbs溶液以自然流速放出，移入待净化液，以1滴/s的流速过柱，再用10ml水淋洗，抽干，用5ml乙酸-甲醇溶液(2+98)洗脱，洗脱液于45℃氮气吹干，加入1.0ml甲酸溶液(0.1%)-乙腈溶液(1+1)溶解残渣，超声1min，过0.22μm 的有机相微孔滤膜后，供液相色谱-串联质谱分析。
11.4 仪器参考条件
11.4.1 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下：
a) 色谱柱：gel amide-80柱，柱长150mm，内径2mm，粒径5μm，或等效柱。
b) 流速：0.3ml/min。
c) 柱温：40℃。
d) 进样量：10μl。
e) 流动相及梯度洗脱条件见表1。流动相a 液：含5mmol/l乙酸铵的0.1%甲酸溶液；流动相b液：乙腈。
11.4.2 质谱参考条件
质谱参考条件列出如下：
a) 离子源：电喷雾源(esi)；
b) 扫描模式：正离子扫描；
c) 喷雾电压：4800v；
d) 鞘气流量：12l/min；
e) 辅助气流量：2l/min；
f) 离子传输管温度：350℃；
g) 源内碰撞诱导解离电压：10v；
h) 扫描模式：选择反应监测模式，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2；
i) 碰撞气压力：氩气，1.5mtorr。
11.5 标准曲线的制作
将河豚毒素标准系列工作液分别注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作液中河豚毒素的浓度为横坐标，以河豚毒素色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
11.6 试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，得到响应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中河豚毒素的浓度。河豚毒素标准溶液的提取离子色谱图参见附录c中图c.1。
11.7 定性
在同样测试条件下，试样溶液中与标准溶液中河豚毒素的保留时间相比，偏差在±2.5%以内，且检测到的离子相对丰度，应当与浓度相近的标准工作液中离子相对丰度一致，其丰度比偏差应符合表3要求。
11.8 空白实验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
12 分析结果的表述
试样中河豚毒素的含量按式(2)计算：
式中：
x ——试样中河豚毒素的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c ——试样待测液中河豚毒素的浓度，单位为微克每升(μg/l)；
v ——定容体积，单位为毫升(ml)；
f ——试液稀释倍数，按照11.2进行试样前处理时为5；
m ——试样的称样量，单位为克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
13 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
14 其他
本方法的检出限为1μg/kg，定量限为3μg/kg。
第三法 液相色谱-荧光检测法
15 原理
采用酸性甲醇溶液提取试样中的河豚毒素，提取液经旋转蒸发至干，用2ml乙酸溶液(1%)溶解残渣，再用磷酸盐缓冲溶液复溶，调ph 至6.0~7.0，经免疫亲和柱净化，液相色谱-柱后衍生荧光法测定，以保留时间定性，外标法定量。
16 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为gb 6682规定的一级水。
16.1 试剂
16.1.1 甲醇(ch3oh)：色谱纯。
16.1.2 甲酸(chooh)：色谱纯。
16.1.3 乙腈(ch3cn)：色谱纯。
16.1.4 冰乙酸(ch3cooh)：色谱纯。
16.1.5 乙酸铵(ch3coonh4)：色谱纯。
16.1.6 十二水合磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)。
16.1.7 二水合磷酸二氢钠(nah2po4·2h2o)。
16.1.8 氯化钠(nacl)。
16.1.9 氢氧化钠(naoh)。
16.1.10 庚烷磺酸钠(c7h15nao3s)。
16.1.11 碳酸钠(na2co3)。
16.2 试剂配制
16.2.1 氢氧化钠溶液(1mol/l)：称取40g氢氧化钠，加水溶解稀释至1000ml。
16.2.2 磷酸盐缓冲液(pbs溶液)：分别称取6.45g十二水合磷酸氢二钠、1.09g二水合磷酸二氢钠、4.25g氯化钠，用水溶解并定容至500ml。
16.2.3 乙酸-甲醇溶液(1+99)：将冰乙酸和甲醇按1比99的体积比混合均匀。
16.2.4 乙酸-甲醇溶液(2+98)：将冰乙酸和甲醇按2比98的体积比混合均匀。
16.2.5 乙酸铵缓冲液：称取4.6g乙酸铵和2.02g庚烷磺酸钠，加入约700ml水溶解，用冰乙酸调节ph 为5.0，用水稀释至1l。
16.2.6 氢氧化钠溶液(4mol/l)：称取160g氢氧化钠，用水溶解并稀释至1l。
16.2.7 乙酸溶液(1%)：冰乙酸和水按1比99的体积比混合均匀。
16.3 标准品
河豚毒素(c11h17n3o8，cas号：4368-28-9)，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
16.4 标准溶液配制
16.4.1 标准储备液(100μg/ml)：准确称取河豚毒素标准品10mg(精确至0.1mg)，用少量水溶解。以甲醇定容至100ml。置于4℃中可保存一个月。
16.4.2 标准工作液：根据需要取适量标准储备液，以乙酸溶液(1%)稀释成适当浓度的标准工作液。临用现配。
16.4.3 基质匹配标准系列工作液：以空白基质溶液配制适当浓度的标准系列工作液。现用现配。
16.5 材料
16.5.1 河豚毒素免疫亲和柱：柱规格3ml，最大柱容量1000ng，或等效柱。
16.5.2 0.22μm 水相微孔滤膜。
17 仪器和设备
17.1 液相色谱仪：配有荧光检测器与柱后衍生装置。
17.2 电子天平：感量0.1mg和0.01g。
17.3 组织捣碎机。
17.4 振荡器。
17.5 超声波发生器。
17.6 固相萃取装置。
17.7 离心机：≥8000r/min。
17.8 氮吹仪。
18 分析步骤
注：为避免毒素的危害，应戴手套进行操作。移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在1mol/l氢氧化钠溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解。
18.1 试样制备
用水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、皮肤和性腺(精巢或卵巢)等部分，各部分组织分别用水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后将各组织剪碎，充分均质，装入清洁容器内，并标明标记。
18.2 试样提取
称取2g(精确到0.01g)试样置于50ml聚丙烯离心管中，加入10ml 乙酸-甲醇溶液(1+99)，振荡2min，60℃水浴超声提取30min，4500r/min离心5min。上清液于60℃旋转蒸发浓缩至近干，加入2ml乙酸溶液(1%)充分溶解残渣，转移至10ml聚丙烯离心管中，加入8mlpbs溶液稀释，用氢氧化钠溶液(1mol/l)调节ph 至7~8，待净化。
18.3 试样净化
将免疫亲和柱回温至室温，去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，移入10ml待净化液。净化液全部流出后，用10ml 水淋洗，适当施压挤干柱内液体。用4ml 乙酸-甲醇溶液(2+98)洗脱，收集的洗脱液于50℃氮气吹干，用乙酸溶液(1%)溶解并定容至1ml，经0.22μm 的水相微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱-荧光法分析。
18.4 仪器参考条件
18.4.1 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下：
a) 色谱柱：c18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或等效柱。
b) 流动相：乙腈-乙酸铵缓冲液(5+95，体积比)。
c) 流速：1.0ml/min。
d) 柱温：30℃。
e) 检测波长：激发波长385nm，发射波长505nm。
f) 进样量：40μl。
18.4.2 柱后衍生参考条件
柱后衍生参考条件列出如下：
a) 衍生溶液：氢氧化钠(4mol/l)。
b) 衍生溶液流速：0.5ml/min。
c) 衍生管温度：110℃。
18.5 标准曲线的制作
将基质匹配标准系列工作液分别注入液相色谱中，测定相应的峰面积，以标准工作液中河豚毒素的浓度为横坐标，以河豚毒素色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。河豚毒素标准溶液的液相色谱图参见图c.2。
18.6 试样溶液的测定
将试样待测液注入液相色谱中，以保留时间进行定性(试样待测液中河豚毒素色谱峰的保留时间与标准溶液相比，偏差在±2.5%之内)，测定相应的峰面积，根据标准曲线得到试样待测液中河豚毒素的浓度。
18.7 空白实验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
19 分析结果的表述
试样中河豚（tun）毒素的含量按式(3)计算：
式中：
x ——试样中河豚（tun）毒素的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c ——试样待测液中河豚（tun）毒素的浓度，单位为微克每升(μg/l)；
c0——空白待测液中河豚（tun）毒素的浓度，单位为微克每升(μg/l)；
v ——定容体积，单位为毫升(ml)；
f ——稀释倍数；
m ——试样的称样量，单位为克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
20 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
21 其他
本方法的检出限为50μg/kg，定量限为150μg/kg。
第四法 酶联免疫吸附法
22 原理
试样中的河豚（tun）毒素经提取、脱脂后与定量的特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，然后加入酶标二抗与结合到酶标板上的抗体反应，加入底物显色，与标准曲线比较测定河豚（tun）毒素含量。
23 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为gb6682规定的一级水。
23.1 试剂
23.1.1 抗河豚（tun）毒素单克隆抗体。
23.1.2 牛血清白蛋白(bsa)。
23.1.3 包被抗原：牛血清白蛋白-甲醛-河豚（tun）毒素连接物(bsa-hcho-ttx)，-20℃保存。
23.1.4 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体。
23.1.5 冰乙酸(ch3cooh)。
23.1.6 氢氧化钠(naoh)。
23.1.7 乙酸钠(ch3coona)。
23.1.8 乙醚(c4h10o)。
23.1.9 n ，n-二甲基甲酰胺(c3h7no)。
23.1.10 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(tmb，c16h20n2)。
23.1.11 碳酸钠(na2co3)。
23.1.12 碳酸氢钠(nahco3)。
23.1.13 磷酸二氢钾(kh2po4)。
23.1.14 十二水合磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)。
23.1.15 氯化钠(nacl)。
23.1.16 氯化钾(kcl)。
23.1.17 过氧化氢(h2o2)。
23.1.18 吐温-20(c58h114o26)。
23.1.19 一水合柠檬酸(c6h8o7·h2o)。
23.1.20 硫酸(h2so4)。
23.2 试剂配制
23.2.1 乙酸钠溶液(0.2mol/l)：称取16.40g乙酸钠，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.2 乙酸溶液(0.2mol/l)：量取11.5ml冰乙酸注入水中，并定容至1000ml。
23.2.3 乙酸盐缓冲液(ph4.0)：将乙酸钠溶液(0.2mol/l)和乙酸溶液(0.2mol/l)按2比8的体积比混合均匀。
23.2.4 磷酸盐缓冲液(pbs溶液，ph7.4)：分别称取磷酸二氢钾0.20g、十二水合磷酸氢二钠2.90g、氯化钠8.00g、氯化钾0.20g，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.5 包被缓冲液(ph9.6)：分别称取碳酸钠1.59g和碳酸氢钠2.93g，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.6 封闭液：称取2.0gbsa，加pbs溶液溶解并定容至1000ml。
23.2.7 pbs-t洗液：吸取0.5ml吐温-20至900mlpbs溶液中，并用pbs溶液定容至1000ml。
23.2.8 抗体稀释液：称取1.0gbsa，加pbs溶液溶解并定容至1000ml。
23.2.9 柠檬酸溶液(0.1mol/l)：称取21.01g一水合柠檬酸，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.10 磷酸氢二钠溶液(0.2mol/l)：称取71.6g十二水合磷酸氢二钠，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.11 底物缓冲液：将柠檬酸溶液(0.1mol/l)、磷酸氢二钠溶液(0.2mol/l)和水按24.3∶25.7∶50的体积混合均匀。现用现配。
23.2.12 tmb储存液：称取200mgtmb，用20mln ，n-二甲基甲酰胺溶解，4℃避光保存。
23.2.13 底物溶液：将75μltmb储存液、10ml底物缓冲液和10μl 过氧化氢混合。
23.2.14 硫酸溶液(2mol/l)：吸取106ml硫酸，缓缓加入500ml水中，并用水稀释至1000ml。
23.2.15 乙酸溶液(0.1%)：吸取1ml冰乙酸加入到999ml水中，混匀。
23.2.16 氢氧化钠溶液(1mol/l)：称取40g氢氧化钠，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.17 抗河豚（tun）毒素单克隆抗体工作液：抗河豚（tun）毒素单克隆抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度。
23.2.18 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体工作液：用抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体稀释至工作浓度。
23.3 标准品
河豚（tun）毒素(c11h17n3o8，cas号：4368-28-9)，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
23.4 标准溶液配制
23.4.1 河豚（tun）毒素标准储备液(1.0g/l)：准确称取适量河豚（tun）毒素标准品，用乙酸盐缓冲液(ph4.0)溶解并定容，配成浓度为1.0g/l的标准储备液，密封后4℃保存备用。
23.4.2 河豚（tun）毒素标准系列工作液：将河豚（tun）毒素标准储备液(1.0g/l)用pbs溶液配制成浓度分别为5000.0μg/l、2500.0μg/l、1000.0μg/l、500.0μg/l、250.0μg/l、100.0μg/l、50.0μg/l、25.0μg/l、10.0μg/l、5.0μg/l、1.0μg/l、0.5μg/l、0μg/l的河豚（tun）毒素标准系列工作液，现用现配。
23.5 材料
定量滤纸。
24 仪器和设备
24.1 全波长光栅酶标仪或配有450nm 滤光片的酶标仪。
24.2 电子天平：感量0.1mg和0.01g。
24.3 高速离心机：≥12000r/min。
24.4 组织匀浆器。
24.5 37℃恒温培养箱。
24.6 温控磁力搅拌器。
25 分析步骤
25.1 试样制备
对新鲜或冷冻后解冻的样品，用水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢(雄性为精囊)等部分，各部分组织分别用水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后称重。
25.2 试样提取
将待测河豚鱼组织用剪刀剪碎，加入5倍体积的乙酸溶液(0.1%)[即1g组织中加入乙酸溶液(0.1%)5ml]，用组织匀浆器磨成糊状。取相当于5g河豚组织的匀浆糊(即25ml)于烧杯中，置温控磁力搅拌器上边加热边搅拌，达到100 ℃时持续10 min后取下，冷却至室温后，8000r/min离心15min，快速过滤于125ml分液漏斗中。滤纸残渣用20ml乙酸溶液(0.1%)分次洗净，合并洗液，置温控磁力搅拌器上边加热边搅拌，达到100℃时持续3min后取下，8000r/min离心15min，合并上清液。加入等体积的乙醚振摇脱脂，静置分层后，放出水层至另一分液漏斗中并以等体积乙醚再重复脱脂一次，将水层放入100ml锥形瓶中，于35℃旋转蒸发去除其中残存的乙醚，将提取液移入50ml容量瓶中。用氢氧化钠溶液(1mol/l)调ph 至6.5~7.0，并用pbs溶液定容至50ml，立即用于检测(每毫升提取液相当于0.1g河豚组织试样)。当日不能检测的提取液经减压浓缩去除其中残存的乙醚后不调ph，密封后-20℃冷冻保存，在检测前调节ph 并定容至50ml，立即检测。
25.3 测定
25.3.1 包被酶标微孔板
用包被抗原包被酶标板，120μl/孔，4℃静置12h。
25.3.2 抗体抗原反应
将抗河豚（tun）毒素单克隆抗体工作液分别与不同浓度的河豚（tun）毒素标准系列工作液等体积混合于2ml试管内，4℃静置12h或37℃温育2h，备用。此溶液用于制作河豚（tun）毒素的标准曲线。
将抗河豚（tun）毒素单克隆抗体工作液与试样提取液等体积混合于2ml试管内，4℃静置12h或37℃温育2h，备用。此溶液用于测定试样中河豚（tun）毒素的含量。
25.3.3 封闭
已包被的酶标板用pbs-t洗液洗涤3次(每次浸泡3min)后，加封闭液封闭，200μl/孔，置37 ℃温育2h。
25.3.4 显色及测定
封闭后的酶标板用pbs-t洗液洗涤3次(每次浸泡3min)，加入25.3.2中制备好的抗原抗体反应液(在酶标板的适当孔位加抗体稀释液作为阴性对照)，100μl/孔，37 ℃温育2h，酶标板用pbs-t 洗液洗涤3次(每次浸泡3min)后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体工作液，100μl/孔，37 ℃温育1h，酶标板用pbs-t 洗液洗涤5次(每次浸泡3min)，加新配制的底物溶液，100μl/孔，37 ℃温育15min后，每孔加入50μl硫酸溶液(2mol/l)终止显色反应，在波长450nm 处测定吸光度值。
25.4 标准曲线的制作
根据25.3.4中获得的河豚（tun）毒素标准系列的吸光度值，以河豚（tun）毒素标准系列工作液的浓度的对数值(以10为底的对数值)为横坐标，以河豚（tun）毒素标准系列工作液的吸光度值与0μg/l的河豚（tun）毒素标准工作液的吸光度值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。
25.5 空白实验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
26 分析结果的表述
试样中河豚毒素含量按式(4)计算：
式中：
x ——试样中河豚毒素的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c ——由标准曲线得到的试样待测液中河豚毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
v ——定容体积，单位为毫升(ml)；
f ——稀释倍数；
m ——试样的称样量，单位为克(g)。
27 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
28 其他
本方法的检出限为3μg/kg，定量限为10μg/kg。
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gb 5009.206-2016
食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定
前 言
本标准代替gb/t 23217-2008《水产品中河豚毒素的测定 液相色谱-荧光检测法》、gb/t 5009.206-2007《鲜河豚鱼中河豚毒素的测定》和sn/t 1569.2-2013《出口河豚鱼中河豚毒素检测方法 第2部分：小鼠生物法》。
本标准与gb/t 5009.206-2007相比，主要变化如下：
——标准名称修改为“食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定”；
——增加了净化步骤；
——修改了酶联免疫吸附法。
1 范围
本标准规定了水产品中河豚毒素的测定方法。
本标准第一法适用于河豚鱼肌肉、肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定。第二法适用于河豚鱼肌肉、肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定。第三法适用于河豚鱼、织纹螺、虾、牡蛎、花蛤和鱿鱼中河豚毒素的测定。第四法适用于河豚鱼肌肉、肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定。
第一法 小鼠生物法
2 原理
根据河豚毒素易溶于酸性溶液原理，试样制备后经两次乙酸溶液(0.5%)煮沸提取，20000g离心收集上清液，将两次上清液合并定容至25ml，用于小鼠生物试验。根据小鼠注射试样提取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重校正鼠单位，计算确定河豚毒素含量。
3 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为gb6682规定的三级水。
3.1 试剂
3.1.1 冰乙酸(ch3cooh)。
3.1.2 氢氧化钠(naoh)。
3.2 试剂配制
3.2.1 乙酸溶液(0.5%)：将5ml冰乙酸用水稀释至1l。
3.2.2 氢氧化钠溶液(1mol/l)：将40g氢氧化钠用水溶解并定容至1000ml。
3.3 标准品
河豚毒素(c11h17n3o8，cas号：4368-28-9)，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4 实验动物
小白鼠：体重19.0g~21.0g，无特定病原体级(spf)昆明系雄性健康小鼠。
4 仪器和设备
4.1 均质器：≥12000r/min。
4.2 电子天平：感量0.1g。
4.3 离心机：离心力≥30000g。
4.4 秒表。
5 分析步骤
注：为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作。移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在氢氧化钠溶液
(1mol/l)中浸泡1h以上，以使毒素分解。
5.1 试样制备
5.1.1 冷冻河豚鱼样品
将样品装于密封塑料袋内于自来水水流下快速解冻。解冻后用水洗净，用滤纸吸干，分解成肌肉、肝脏、皮肤等部分。分别称量后将各组织剪碎，充分均质。
5.1.2 新鲜河豚鱼样品
将样品用水洗净后用滤纸吸干，分解成肌肉、肝脏、皮肤等部分，分别称量后将各组织剪碎，充分均质。
5.2 试样提取
5.2.1 肌肉组织试样
准确称取试样10g(精确至0.1g)于50ml离心管中，加入乙酸溶液(0.5%)11ml，充分混匀，沸水浴中煮沸10min，不断搅拌以防止组织结块。冷却至室温，20000g 高速离心20min，移取上清液于25ml容量瓶中。向沉淀中加入乙酸溶液(0.5%)11ml，充分混匀，沸水浴中煮沸5min，不断搅拌以防止组织结块。冷却至室温，20000g 高速离心20min，移取上清液。合并上清液，混匀，用乙酸溶液(0.5%)定容至25ml。此提取液1ml相当于0.4g试样。
5.2.2 肝脏组织试样
准确称取10g(精确至0.1g)试样于50ml离心管中，加入乙酸溶液(0.5%)8ml，充分混匀，室温下20000g 高速离心20min，移取上清液于25ml容量瓶中。用8ml 乙酸溶液(0.5%)重复提取1次。合并上清液，混匀，用乙酸溶液(0.5%)定容至25ml。此提取液1ml相当于0.4g试样。
5.2.3 皮肤组织试样
准确称取10g(精确至0.1g)试样于50ml离心管中，加入乙酸溶液(0.5%)11ml，充分混匀，室温下20000g 高速离心20min，移取上清液于25ml容量瓶中。用11ml乙酸溶液(0.5%)重复提取1次。合并上清液，用乙酸溶液(0.5%)定容至25ml。此提取液1ml相当于0.4g试样。
注1：试样制备时，冷冻样品需在半解冻状态下进行操作。试样若不能及时检验，应于4℃保存，在24h内检验。
注2：如果河豚鱼样品的脏器或者组织不足10g的情况下，按照以上方法进行提取操作，需适量减少乙酸溶液(0.5%)的加入量。
注3：提取液中应不含有离心分离液表面上被分离出来的油状物、胶状物或者脂质类。
5.3 小鼠试验
选取19.0g~21.0g的无特定病原体级(spf)昆明系雄性健康小鼠6只，称量并记录体重。随机分为实验组和空白对照组两组，每组3只。对每只试验小鼠腹腔注射1 ml 试样提取液或乙酸溶液(0.5%)(空白对照液)。若注射过程中注射液溢出，须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。记录注射开始和完毕时间，仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间(到小鼠呼出最后一口气止)。
若注射试样提取液后，小鼠死亡时间小于7min，则按附录a 中表a.1计算出1ml试样提取液的毒力，以此为基准，配制出使小鼠在7min~13min死亡所需的稀释液，采用乙酸溶液(0.5%)进行稀释，将稀释液再注射至少3只小鼠以确定试样的毒力。具体示例见附录b。若注射试样溶液后，小鼠的死亡时间大于或等于7min，则直接根据中位数致死时间确定试样的毒力。
小鼠中毒死亡症状：被注射了河豚毒素的小鼠初期安静，随后出现呼吸困难，急促，腹部收缩加快，反应迟钝，继而出现突然疾走，急跑急跳，四处乱窜，东倒西歪，翻转乱跳等挣扎动作，数十秒后，小鼠后腿剧烈抽搐，2~3次后爬卧不动，腹部呼吸逐渐微弱减慢，最后死亡。以停止呼吸作为判断死亡的标准。
6 分析结果的表述
6.1 毒力的计算
根据小鼠试验中得到的小鼠致死时间，计算出中位数致死时间，然后按表a.1计算出毒力(若中位数致死时间刚好处于表a.1中给出的两时间中间时，则取两时间中较大的时间值；若介于表a.1中给出的两时间中但不正好处于中间时，则取更接近于中位数致死时间的时间值)。若小鼠体重不正好为20.0g，则按表a.2对鼠单位(mu)进行校正，通过校正后的鼠单位表示出提取液的毒力。
1mu 的定义为使体重为20.0g的无特定病原体级(spf)昆明系雄性小鼠30min死亡的毒力，相当于0.18μg河豚毒素。
试样中河豚毒素的含量按式(1)计算：
式中：
x ——试样中河豚毒素的含量，单位为鼠单位每克(mu/g)；
m ——1ml注射液的鼠单位数，单位为鼠单位(mu)；
e ——提取系数，本方法提取系数为3.11；
f ——试样提取液的稀释倍数；
w ——小鼠体重校正系数。
6.2 结果报告
在空白对照组小鼠正常的情况下，河豚鱼各组织中河豚毒素含量进行如下判断和表述：
若小鼠的死亡时间大于30min，结果报告为<3.11mu/g肌肉组织/肝脏/皮肤。
若小鼠的死亡时间小于30min，结果按式(1)计算得到实际结果报告，待测样品中河豚毒素含量为××× mu/g肌肉组织/肝脏/皮肤。
若3只小鼠死亡时间不都小于30min或不都大于30min，则需重新注射3只小鼠，以确保3只小鼠死亡时间都小于30min或都大于30min，结果据此判定；若重复注射3只小鼠死亡时间仍出现第一次小鼠死亡情况，则需根据第一次注射3只小鼠的中位数致死时间判定结果。
7 其他
本方法的检出限为3.11mu/g。
第二法 液相色谱-串联质谱法
8 原理
试样经1%乙酸-甲醇溶液提取，免疫亲和柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。
9 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为gb 6682规定的一级水。
9.1 试剂
9.1.1 甲醇(ch3oh)：色谱纯。
9.1.2 乙腈(ch3cn)：色谱纯。
9.1.3 甲酸(hcooh)：色谱纯。
9.1.4 冰乙酸(ch3cooh)：优级纯。
9.1.5 乙酸铵(ch3coonh4)：色谱纯。
9.1.6 十二水合磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)。
9.1.7 二水合磷酸二氢钠(nah2po4·2h2o)。
9.1.8 氯化钠(nacl)。
9.1.9 氢氧化钠(naoh)。
9.2 试剂配制
9.2.1 乙酸-甲醇溶液(1+99)：将冰乙酸和甲醇按1比99的体积比混合均匀。
9.2.2 乙酸-甲醇溶液(2+98)：将冰乙酸和甲醇按2比98的体积比混合均匀。
9.2.3 甲酸溶液(1+999)：将1ml甲酸加入到999ml水中，混匀。
9.2.4 含5mmol/l乙酸铵的0.1%甲酸溶液：称取0.19g乙酸铵，加入0.1%甲酸溶液定容至500ml。
9.2.5 甲酸溶液(0.1%)-乙腈溶液(1+1)：甲酸溶液(0.1%)与乙腈等体积混合均匀。
9.2.6 磷酸盐缓冲溶液(pbs溶液)：称取十二水合磷酸氢二钠6.45g、二水合磷酸二氢钠1.09g、氯化钠4.25g，用水溶解并定容至500ml。
9.2.7 氢氧化钠溶液(1mol/l)：准确称取20.0g氢氧化钠，用水溶解并定容至500ml。
9.3 标准品
河豚毒素(c11h17n3o8，cas号：4368-28-9)，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
9.4 标准溶液配制
9.4.1 河豚毒素标准储备液(100μg/ml)：准确称取河豚毒素标准品10mg(精确至0.1mg)，用少量甲酸溶液(0.1%)溶解，以甲醇定容至100ml，-18℃以下避光保存。
9.4.2 河豚毒素标准中间液(1μg/ml)：准确量取河豚毒素标准储备液(100μg/ml)适量，以甲酸溶液(0.1%)-乙腈溶液(1+1)稀释并定容，配制成1μg/ml的标准中间液，-18℃以下避光保存。
9.4.3 河豚毒素标准系列工作液：准确吸取河豚毒素标准中间液(1μg/ml)适量，以甲酸溶液(0.1%)-乙腈溶液(1+1)稀释并定容，得到浓度为1μg/l~1000μg/l的标准系列工作液，现用现配。
9.5 材料
9.5.1 河豚毒素免疫亲和柱：柱规格3ml，最大柱容量1000ng，或等效柱。
9.5.2 0.22μm 有机相微孔滤膜。
10 仪器和设备
10.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
10.2 分析天平：感量为0.1mg和0.01g。
10.3 均质机：≥12000r/min。
10.4 涡旋振荡器。
10.5 高速冷冻离心机：转速≥8000r/min。
10.6 固相萃取装置。
10.7 氮吹仪。
11 分析步骤
注：为避免毒素的危害，应戴手套进行操作。移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在氢氧化钠溶液(1mol/l)中浸泡1h以上，以使毒素分解。
11.1 试样制备
用水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、皮肤和性腺(精巢或卵巢)等部分，各部分组织分别用水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后将各组织剪碎，充分均质，装入清洁容器内，并标明标记。
11.2 试样提取
称取5g(精确到0.01g)匀浆试样于50ml具塞离心管中，加入11ml乙酸-甲醇溶液(1+99)，涡旋振荡2min，50℃水浴超声提取15min，以8000r/min离心5min，转移上清液于25ml容量瓶中。
向残渣中加入11ml乙酸-甲醇溶液(1+99)，重复提取一次，合并上清液，用乙酸-甲醇溶液(1+99)定容至25ml。移取约10ml提取液至另一50ml具塞离心管中，-20℃冷冻30min，再以8000r/min离心5min，准确移取5ml上清液，加入20mlpbs溶液进行稀释，用氢氧化钠溶液(1mol/l)调ph 在7~8范围内，待净化。
11.3 试样净化
将免疫亲和柱中封存的pbs溶液以自然流速放出，移入待净化液，以1滴/s的流速过柱，再用10ml水淋洗，抽干，用5ml乙酸-甲醇溶液(2+98)洗脱，洗脱液于45℃氮气吹干，加入1.0ml甲酸溶液(0.1%)-乙腈溶液(1+1)溶解残渣，超声1min，过0.22μm 的有机相微孔滤膜后，供液相色谱-串联质谱分析。
11.4 仪器参考条件
11.4.1 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下：
a) 色谱柱：gel amide-80柱，柱长150mm，内径2mm，粒径5μm，或等效柱。
b) 流速：0.3ml/min。
c) 柱温：40℃。
d) 进样量：10μl。
e) 流动相及梯度洗脱条件见表1。流动相a 液：含5mmol/l乙酸铵的0.1%甲酸溶液；流动相b液：乙腈。
11.4.2 质谱参考条件
质谱参考条件列出如下：
a) 离子源：电喷雾源(esi)；
b) 扫描模式：正离子扫描；
c) 喷雾电压：4800v；
d) 鞘气流量：12l/min；
e) 辅助气流量：2l/min；
f) 离子传输管温度：350℃；
g) 源内碰撞诱导解离电压：10v；
h) 扫描模式：选择反应监测模式，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2；
i) 碰撞气压力：氩气，1.5mtorr。
11.5 标准曲线的制作
将河豚毒素标准系列工作液分别注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作液中河豚毒素的浓度为横坐标，以河豚毒素色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
11.6 试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，得到响应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中河豚毒素的浓度。河豚毒素标准溶液的提取离子色谱图参见附录c中图c.1。
11.7 定性
在同样测试条件下，试样溶液中与标准溶液中河豚毒素的保留时间相比，偏差在±2.5%以内，且检测到的离子相对丰度，应当与浓度相近的标准工作液中离子相对丰度一致，其丰度比偏差应符合表3要求。
11.8 空白实验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
12 分析结果的表述
试样中河豚毒素的含量按式(2)计算：
式中：
x ——试样中河豚毒素的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c ——试样待测液中河豚毒素的浓度，单位为微克每升(μg/l)；
v ——定容体积，单位为毫升(ml)；
f ——试液稀释倍数，按照11.2进行试样前处理时为5；
m ——试样的称样量，单位为克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
13 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
14 其他
本方法的检出限为1μg/kg，定量限为3μg/kg。
第三法 液相色谱-荧光检测法
15 原理
采用酸性甲醇溶液提取试样中的河豚毒素，提取液经旋转蒸发至干，用2ml乙酸溶液(1%)溶解残渣，再用磷酸盐缓冲溶液复溶，调ph 至6.0~7.0，经免疫亲和柱净化，液相色谱-柱后衍生荧光法测定，以保留时间定性，外标法定量。
16 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为gb 6682规定的一级水。
16.1 试剂
16.1.1 甲醇(ch3oh)：色谱纯。
16.1.2 甲酸(chooh)：色谱纯。
16.1.3 乙腈(ch3cn)：色谱纯。
16.1.4 冰乙酸(ch3cooh)：色谱纯。
16.1.5 乙酸铵(ch3coonh4)：色谱纯。
16.1.6 十二水合磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)。
16.1.7 二水合磷酸二氢钠(nah2po4·2h2o)。
16.1.8 氯化钠(nacl)。
16.1.9 氢氧化钠(naoh)。
16.1.10 庚烷磺酸钠(c7h15nao3s)。
16.1.11 碳酸钠(na2co3)。
16.2 试剂配制
16.2.1 氢氧化钠溶液(1mol/l)：称取40g氢氧化钠，加水溶解稀释至1000ml。
16.2.2 磷酸盐缓冲液(pbs溶液)：分别称取6.45g十二水合磷酸氢二钠、1.09g二水合磷酸二氢钠、4.25g氯化钠，用水溶解并定容至500ml。
16.2.3 乙酸-甲醇溶液(1+99)：将冰乙酸和甲醇按1比99的体积比混合均匀。
16.2.4 乙酸-甲醇溶液(2+98)：将冰乙酸和甲醇按2比98的体积比混合均匀。
16.2.5 乙酸铵缓冲液：称取4.6g乙酸铵和2.02g庚烷磺酸钠，加入约700ml水溶解，用冰乙酸调节ph 为5.0，用水稀释至1l。
16.2.6 氢氧化钠溶液(4mol/l)：称取160g氢氧化钠，用水溶解并稀释至1l。
16.2.7 乙酸溶液(1%)：冰乙酸和水按1比99的体积比混合均匀。
16.3 标准品
河豚毒素(c11h17n3o8，cas号：4368-28-9)，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
16.4 标准溶液配制
16.4.1 标准储备液(100μg/ml)：准确称取河豚毒素标准品10mg(精确至0.1mg)，用少量水溶解。以甲醇定容至100ml。置于4℃中可保存一个月。
16.4.2 标准工作液：根据需要取适量标准储备液，以乙酸溶液(1%)稀释成适当浓度的标准工作液。临用现配。
16.4.3 基质匹配标准系列工作液：以空白基质溶液配制适当浓度的标准系列工作液。现用现配。
16.5 材料
16.5.1 河豚毒素免疫亲和柱：柱规格3ml，最大柱容量1000ng，或等效柱。
16.5.2 0.22μm 水相微孔滤膜。
17 仪器和设备
17.1 液相色谱仪：配有荧光检测器与柱后衍生装置。
17.2 电子天平：感量0.1mg和0.01g。
17.3 组织捣碎机。
17.4 振荡器。
17.5 超声波发生器。
17.6 固相萃取装置。
17.7 离心机：≥8000r/min。
17.8 氮吹仪。
18 分析步骤
注：为避免毒素的危害，应戴手套进行操作。移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在1mol/l氢氧化钠溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解。
18.1 试样制备
用水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、皮肤和性腺(精巢或卵巢)等部分，各部分组织分别用水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后将各组织剪碎，充分均质，装入清洁容器内，并标明标记。
18.2 试样提取
称取2g(精确到0.01g)试样置于50ml聚丙烯离心管中，加入10ml 乙酸-甲醇溶液(1+99)，振荡2min，60℃水浴超声提取30min，4500r/min离心5min。上清液于60℃旋转蒸发浓缩至近干，加入2ml乙酸溶液(1%)充分溶解残渣，转移至10ml聚丙烯离心管中，加入8mlpbs溶液稀释，用氢氧化钠溶液(1mol/l)调节ph 至7~8，待净化。
18.3 试样净化
将免疫亲和柱回温至室温，去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，移入10ml待净化液。净化液全部流出后，用10ml 水淋洗，适当施压挤干柱内液体。用4ml 乙酸-甲醇溶液(2+98)洗脱，收集的洗脱液于50℃氮气吹干，用乙酸溶液(1%)溶解并定容至1ml，经0.22μm 的水相微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱-荧光法分析。
18.4 仪器参考条件
18.4.1 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下：
a) 色谱柱：c18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或等效柱。
b) 流动相：乙腈-乙酸铵缓冲液(5+95，体积比)。
c) 流速：1.0ml/min。
d) 柱温：30℃。
e) 检测波长：激发波长385nm，发射波长505nm。
f) 进样量：40μl。
18.4.2 柱后衍生参考条件
柱后衍生参考条件列出如下：
a) 衍生溶液：氢氧化钠(4mol/l)。
b) 衍生溶液流速：0.5ml/min。
c) 衍生管温度：110℃。
18.5 标准曲线的制作
将基质匹配标准系列工作液分别注入液相色谱中，测定相应的峰面积，以标准工作液中河豚毒素的浓度为横坐标，以河豚毒素色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。河豚毒素标准溶液的液相色谱图参见图c.2。
18.6 试样溶液的测定
将试样待测液注入液相色谱中，以保留时间进行定性(试样待测液中河豚毒素色谱峰的保留时间与标准溶液相比，偏差在±2.5%之内)，测定相应的峰面积，根据标准曲线得到试样待测液中河豚毒素的浓度。
18.7 空白实验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
19 分析结果的表述
试样中河豚（tun）毒素的含量按式(3)计算：
式中：
x ——试样中河豚（tun）毒素的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c ——试样待测液中河豚（tun）毒素的浓度，单位为微克每升(μg/l)；
c0——空白待测液中河豚（tun）毒素的浓度，单位为微克每升(μg/l)；
v ——定容体积，单位为毫升(ml)；
f ——稀释倍数；
m ——试样的称样量，单位为克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
20 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
21 其他
本方法的检出限为50μg/kg，定量限为150μg/kg。
第四法 酶联免疫吸附法
22 原理
试样中的河豚（tun）毒素经提取、脱脂后与定量的特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，然后加入酶标二抗与结合到酶标板上的抗体反应，加入底物显色，与标准曲线比较测定河豚（tun）毒素含量。
23 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为gb6682规定的一级水。
23.1 试剂
23.1.1 抗河豚（tun）毒素单克隆抗体。
23.1.2 牛血清白蛋白(bsa)。
23.1.3 包被抗原：牛血清白蛋白-甲醛-河豚（tun）毒素连接物(bsa-hcho-ttx)，-20℃保存。
23.1.4 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体。
23.1.5 冰乙酸(ch3cooh)。
23.1.6 氢氧化钠(naoh)。
23.1.7 乙酸钠(ch3coona)。
23.1.8 乙醚(c4h10o)。
23.1.9 n ，n-二甲基甲酰胺(c3h7no)。
23.1.10 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(tmb，c16h20n2)。
23.1.11 碳酸钠(na2co3)。
23.1.12 碳酸氢钠(nahco3)。
23.1.13 磷酸二氢钾(kh2po4)。
23.1.14 十二水合磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)。
23.1.15 氯化钠(nacl)。
23.1.16 氯化钾(kcl)。
23.1.17 过氧化氢(h2o2)。
23.1.18 吐温-20(c58h114o26)。
23.1.19 一水合柠檬酸(c6h8o7·h2o)。
23.1.20 硫酸(h2so4)。
23.2 试剂配制
23.2.1 乙酸钠溶液(0.2mol/l)：称取16.40g乙酸钠，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.2 乙酸溶液(0.2mol/l)：量取11.5ml冰乙酸注入水中，并定容至1000ml。
23.2.3 乙酸盐缓冲液(ph4.0)：将乙酸钠溶液(0.2mol/l)和乙酸溶液(0.2mol/l)按2比8的体积比混合均匀。
23.2.4 磷酸盐缓冲液(pbs溶液，ph7.4)：分别称取磷酸二氢钾0.20g、十二水合磷酸氢二钠2.90g、氯化钠8.00g、氯化钾0.20g，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.5 包被缓冲液(ph9.6)：分别称取碳酸钠1.59g和碳酸氢钠2.93g，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.6 封闭液：称取2.0gbsa，加pbs溶液溶解并定容至1000ml。
23.2.7 pbs-t洗液：吸取0.5ml吐温-20至900mlpbs溶液中，并用pbs溶液定容至1000ml。
23.2.8 抗体稀释液：称取1.0gbsa，加pbs溶液溶解并定容至1000ml。
23.2.9 柠檬酸溶液(0.1mol/l)：称取21.01g一水合柠檬酸，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.10 磷酸氢二钠溶液(0.2mol/l)：称取71.6g十二水合磷酸氢二钠，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.11 底物缓冲液：将柠檬酸溶液(0.1mol/l)、磷酸氢二钠溶液(0.2mol/l)和水按24.3∶25.7∶50的体积混合均匀。现用现配。
23.2.12 tmb储存液：称取200mgtmb，用20mln ，n-二甲基甲酰胺溶解，4℃避光保存。
23.2.13 底物溶液：将75μltmb储存液、10ml底物缓冲液和10μl 过氧化氢混合。
23.2.14 硫酸溶液(2mol/l)：吸取106ml硫酸，缓缓加入500ml水中，并用水稀释至1000ml。
23.2.15 乙酸溶液(0.1%)：吸取1ml冰乙酸加入到999ml水中，混匀。
23.2.16 氢氧化钠溶液(1mol/l)：称取40g氢氧化钠，加水溶解并定容至1000ml。
23.2.17 抗河豚（tun）毒素单克隆抗体工作液：抗河豚（tun）毒素单克隆抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度。
23.2.18 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体工作液：用抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体稀释至工作浓度。
23.3 标准品
河豚（tun）毒素(c11h17n3o8，cas号：4368-28-9)，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
23.4 标准溶液配制
23.4.1 河豚（tun）毒素标准储备液(1.0g/l)：准确称取适量河豚（tun）毒素标准品，用乙酸盐缓冲液(ph4.0)溶解并定容，配成浓度为1.0g/l的标准储备液，密封后4℃保存备用。
23.4.2 河豚（tun）毒素标准系列工作液：将河豚（tun）毒素标准储备液(1.0g/l)用pbs溶液配制成浓度分别为5000.0μg/l、2500.0μg/l、1000.0μg/l、500.0μg/l、250.0μg/l、100.0μg/l、50.0μg/l、25.0μg/l、10.0μg/l、5.0μg/l、1.0μg/l、0.5μg/l、0μg/l的河豚（tun）毒素标准系列工作液，现用现配。
23.5 材料
定量滤纸。
24 仪器和设备
24.1 全波长光栅酶标仪或配有450nm 滤光片的酶标仪。
24.2 电子天平：感量0.1mg和0.01g。
24.3 高速离心机：≥12000r/min。
24.4 组织匀浆器。
24.5 37℃恒温培养箱。
24.6 温控磁力搅拌器。
25 分析步骤
25.1 试样制备
对新鲜或冷冻后解冻的样品，用水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢(雄性为精囊)等部分，各部分组织分别用水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后称重。
25.2 试样提取
将待测河豚鱼组织用剪刀剪碎，加入5倍体积的乙酸溶液(0.1%)[即1g组织中加入乙酸溶液(0.1%)5ml]，用组织匀浆器磨成糊状。取相当于5g河豚组织的匀浆糊(即25ml)于烧杯中，置温控磁力搅拌器上边加热边搅拌，达到100 ℃时持续10 min后取下，冷却至室温后，8000r/min离心15min，快速过滤于125ml分液漏斗中。滤纸残渣用20ml乙酸溶液(0.1%)分次洗净，合并洗液，置温控磁力搅拌器上边加热边搅拌，达到100℃时持续3min后取下，8000r/min离心15min，合并上清液。加入等体积的乙醚振摇脱脂，静置分层后，放出水层至另一分液漏斗中并以等体积乙醚再重复脱脂一次，将水层放入100ml锥形瓶中，于35℃旋转蒸发去除其中残存的乙醚，将提取液移入50ml容量瓶中。用氢氧化钠溶液(1mol/l)调ph 至6.5~7.0，并用pbs溶液定容至50ml，立即用于检测(每毫升提取液相当于0.1g河豚组织试样)。当日不能检测的提取液经减压浓缩去除其中残存的乙醚后不调ph，密封后-20℃冷冻保存，在检测前调节ph 并定容至50ml，立即检测。
25.3 测定
25.3.1 包被酶标微孔板
用包被抗原包被酶标板，120μl/孔，4℃静置12h。
25.3.2 抗体抗原反应
将抗河豚（tun）毒素单克隆抗体工作液分别与不同浓度的河豚（tun）毒素标准系列工作液等体积混合于2ml试管内，4℃静置12h或37℃温育2h，备用。此溶液用于制作河豚（tun）毒素的标准曲线。
将抗河豚（tun）毒素单克隆抗体工作液与试样提取液等体积混合于2ml试管内，4℃静置12h或37℃温育2h，备用。此溶液用于测定试样中河豚（tun）毒素的含量。
25.3.3 封闭
已包被的酶标板用pbs-t洗液洗涤3次(每次浸泡3min)后，加封闭液封闭，200μl/孔，置37 ℃温育2h。
25.3.4 显色及测定
封闭后的酶标板用pbs-t洗液洗涤3次(每次浸泡3min)，加入25.3.2中制备好的抗原抗体反应液(在酶标板的适当孔位加抗体稀释液作为阴性对照)，100μl/孔，37 ℃温育2h，酶标板用pbs-t 洗液洗涤3次(每次浸泡3min)后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体工作液，100μl/孔，37 ℃温育1h，酶标板用pbs-t 洗液洗涤5次(每次浸泡3min)，加新配制的底物溶液，100μl/孔，37 ℃温育15min后，每孔加入50μl硫酸溶液(2mol/l)终止显色反应，在波长450nm 处测定吸光度值。
25.4 标准曲线的制作
根据25.3.4中获得的河豚（tun）毒素标准系列的吸光度值，以河豚（tun）毒素标准系列工作液的浓度的对数值(以10为底的对数值)为横坐标，以河豚（tun）毒素标准系列工作液的吸光度值与0μg/l的河豚（tun）毒素标准工作液的吸光度值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。
25.5 空白实验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
26 分析结果的表述
试样中河豚毒素含量按式(4)计算：
式中：
x ——试样中河豚毒素的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c ——由标准曲线得到的试样待测液中河豚毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
v ——定容体积，单位为毫升(ml)；
f ——稀释倍数；
m ——试样的称样量，单位为克(g)。
27 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
28 其他
本方法的检出限为3μg/kg，定量限为10μg/kg。
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