MTT/CCK8/XTT等细胞增殖检测实验分享
实验介绍
(a) mtt
mtt为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料。活细胞在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下四唑环开裂，生成蓝色的甲月替结晶并沉积在细胞中，甲月替结晶的生成量仅仅与活细胞数目成正比（死细胞中的琥珀酸脱氢酶消失，不能还原mtt）。还原生成的甲月替结晶可在含50%的n,n-二甲基甲酰胺、20%的十二甲基磺酸钠（ph 4.7）或10%酸化十二甲基磺酸钠（ph 4.7）的溶液中溶解。利用酶标仪测定490nm波长处的光密度测出od值，即反映活细胞数目。也可利用dmso（二甲基亚砜）来溶解。用dmso之前要尽量去掉培养液，一遍dmso溶解甲月替颗粒，进行比色测定。
1．取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10％小牛血清的rpmi-1640培养液），在37℃ 5％ co2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）
2．用rpmi-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的rpmi-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml rpmi-1640培养液。在37℃ 5％ co2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。
3．吸去培养液，用pbs洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。
4．每孔加0.1ml pbs和10μl mtt染液，在37℃ 5％ co2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。
5．每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10％ sds的10mmol/l hcl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（od）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以od值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
(b) cck-8检测细胞增殖（活力）：
cck-8（cell-counting kit-8）检测试剂盒是应用wst-8取代mtt被还原，wst-8是一种类似于mtt的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。wst-8产生的formazan比xtt和mts产生的formazangeng易溶解。且wst-8相较xtt和mts化学性状geng稳定， 因此实验结果相对geng加稳定。此外，wst-8相较mtt、xtt，线性范围相对宽，灵敏度geng高。
当细胞增殖得越多越快，则formazan产生量越多，颜色越深；反之，当内外因造成的细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖（活性）相关数据。
(c) xtt：
化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2h-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臢产物。当xtt与电子偶合剂（例如pms）联合应用时，其所产生的水溶性的甲臢产物的吸光度与活细胞的数量成正比。
用xtt代替mtt可省去溶解还原产物结晶的步骤，xtt可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在od450处有吸收峰。
优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于mtt。
缺点：xtt水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。
应用范围：
生物活性因子的活性检测；
大规模的抗肿瘤药物筛选；
细胞增殖实验；
药物或基因导致的细胞毒性试验；
药敏试验等。
服务周期：3周。
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1．取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10％小牛血清的rpmi-1640培养液），在37℃ 5％ co2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）
2．用rpmi-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的rpmi-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml rpmi-1640培养液。在37℃ 5％ co2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。
3．吸去培养液，用pbs洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。
4．每孔加0.1ml pbs和10μl mtt染液，在37℃ 5％ co2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。
5．每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10％ sds的10mmol/l hcl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（od）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以od值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
(b) cck-8检测细胞增殖（活力）：
cck-8（cell-counting kit-8）检测试剂盒是应用wst-8取代mtt被还原，wst-8是一种类似于mtt的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。wst-8产生的formazan比xtt和mts产生的formazangeng易溶解。且wst-8相较xtt和mts化学性状geng稳定， 因此实验结果相对geng加稳定。此外，wst-8相较mtt、xtt，线性范围相对宽，灵敏度geng高。
当细胞增殖得越多越快，则formazan产生量越多，颜色越深；反之，当内外因造成的细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖（活性）相关数据。
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化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2h-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臢产物。当xtt与电子偶合剂（例如pms）联合应用时，其所产生的水溶性的甲臢产物的吸光度与活细胞的数量成正比。
用xtt代替mtt可省去溶解还原产物结晶的步骤，xtt可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在od450处有吸收峰。
优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于mtt。
缺点：xtt水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。
应用范围：
生物活性因子的活性检测；
大规模的抗肿瘤药物筛选；
细胞增殖实验；
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服务周期：3周。
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