尘封20年的秘密：从溶血病理机制研究到抗体药物研发
几十年来，科学家们一直致力于研究溶血对器官的损伤作用，但仍未完全发现驱动这种病理现象的内在机制。
近期，来自美国圣裘德儿童医院的研究人员在cell上发表了题为“nlrp12-panoptosome activates panoptosis and pathology in response to heme and pamps”的文章[1]，寻找到一种先天免疫模式识别受体nlrp12，是诱导炎症细胞死亡和病理的关键分子。
值得注意的是，在文章中，incucyte® 实时活细胞分析系统显著地推动了这项研究，并承担了整个实验约80%的工作量，成为构筑论文主体的关键工具。那么，文章是如何应用incucyte® 的呢？
先天免疫是由病原体、病原相关分子模式（pamp）或损伤相关分子模式（damp）激活引起的，增强的免疫激活可导致细胞损伤、组织破坏和器官损伤，以及damp的释放（图1）。模式识别受体（ppr）因其可以感知非特异性pamp或damp的能力而被经典研究，然而，多种pamp和damp对prr的联合激活尚未得到很好的表征。
图1.红细胞破裂、damp释放、联合pamp激发下游信号通路导致细胞死亡
万事开头难，研究人员首先需要建立体外模拟感染并驱动先天免疫和炎症细胞死亡的模型。如图2所示，研究人员选择多种damp、pamp及其组合的诱导细胞死亡的分子，以骨髓源性巨噬细胞(bmdm)为模型，应用incucyte® 检测（图2），结果显示：单独的pamppam3、poly(i:c)、lps或r848处理骨髓源性巨噬细胞(bmdm)，触发死亡比例低。然而，组合pamp在许多组合中都会诱导大量细胞死亡（图2）。同样，单个damp不会诱导bmdm中的细胞死亡，damp的组合也不会诱导细胞死亡。pamp与damp的组合中血红素与pam3、lps或r848的组合细胞死亡反应强烈。由此表明，由特定pamp组合驱动的信号传导以及血红素与pamp的组合可以诱导强烈的细胞死亡。
图2.各种诱导剂组合的细胞死亡代表性图片以及定量图；incucyte® 可以自动获取48小时内pi染色的图像，允许明场和荧光通道的重叠，并标记阳性信号，通过设定分析阈值和背景扣除算法，自动定量分析pi阳性细胞的比例
遵循图1的研究路线，接下来的任务是通过干扰中间受体和信号分子，来探究是否能改变细胞死亡的表型。在这一步骤中，incucyte® 的高通量自动成像和分析功能将全面支持本文的研究，全程自动记录并分析细胞死亡的比例。
incucyte® 不仅可检测常规细胞死亡，使用特殊活细胞检测试剂，还可检测线粒体ros产生。血红素暴露通过产生活性氧(ros)触发巨噬细胞中的细胞死亡。血红素加pamp刺激导致bmdm中线粒体ros(mitoros)的产生（图3ab）。使用ros清除剂n-乙酰l-半胱氨酸(nac)进行处理可显著防止细胞死亡（图3c），表明ros产生与诱导细胞死亡之间存在机制联系。
图3.(a) ros荧光及明场代表性图片由incucyte® 直接导出；(b) incucyte® 计算红色荧光强度值；(c) nac消除剂可防止细胞死亡
在这篇文章中，无论是测试病原相关分子模式（pamp）、损伤相关分子模式（damp）及其组合对细胞死亡的影响，还是后续干扰中间信号分子以观察细胞死亡情况，都涉及到浓度和时间点的精准控制。这时，incucyte® 的实时监测功能就大显神威了，它可以实时检测并确定细胞死亡的最高时间点和最佳浓度，显著降低实验工作量，提高科研效率。
每当我推荐incucyte® 时，总会问一个问题：这台设备能实现什么其他设备无法做到的?这篇文章可能就是答案。
科研工作常常是在最后的20%时间获取80%的结果，大部分时间都处于探索和摸索阶段。而incucyte® 的优势便是能大幅度缩短这一探索阶段的时间。
这项新研究确定nlrp12在诱导炎症细胞死亡质膜破裂从而致病的关键因子，那么其作为药物靶标，可有效减少器官损伤。接下来，让我们看另一篇文章是如何直接利用基础机制设计抗体药物，来接抑制程序性细胞死亡的质膜破裂进而减弱炎症反应，削弱病理损伤的。
关于细胞质膜破裂（pmr）有一个有趣的观点转变。过去的观点认为，pmr是一个由渗透压变化引起的被动过程，细胞是“胀”破的；然而，这个观点在21年被推翻了。进一步研究表明：质膜破裂及ldh和damp的释放需要一种名为ninj1的蛋白参与，如果该蛋白发生突变，pmr就不会发生。因此，我们是否能够通过抑制ninj1来限制过度细胞死亡的质膜破裂呢？
kayagaki等人在nature发表题为“inhibiting membrane rupture with ninj1 antibodies limits tissue injury”的文章，证实了之前提出的设想，即使用ninj1抗体可以抑制程序性细胞死亡的质膜破裂[2]。
为了生产ninj1阻断抗体，使用全长ninj1对ninj1−/−小鼠免疫接种，分离15000个igm阴性-b细胞，对筛选到的217种重组抗小鼠ninj1 igg2a单克隆抗体进行功能筛选，确定clone d1（ninj1-575）是ninj1依赖性pmr的抑制剂（图4a）。同时，clone d1抑制了hek293t细胞中小鼠ninj1（而非人ninj1）异位表达引起的膜损伤（图4b）。
图4.(a) ninj1阻断抗体筛选及生产流程；
图4.(b) 阻断抗体d1抑制异位表达导致的膜损伤，incucyte® 实时检测分析每半小时yoyo+细胞比例
之后，研究人员又使用fitc标记的150kda dextran导入bmdm细胞作为工具，当质膜破裂，荧光信号消失。与同种型对照抗体相比，克隆d1以剂量依赖性方式降低bmdm中的pmr，克隆25表现出质膜破裂阻断活性，但不如克隆d1有效（图5）。
图5.incucyte® 每半小时检测一次dd150阳性细胞比例，质膜破裂的细胞为阴性细胞，蓝色为clone d1曲线，0.1μg/ml浓度就能达到很好的抑制效果。
本研究为从基础研究向临床转化提供了一种高效的研究策略框架。在确定导致疾病的关键病因后，寻求阻断策略便是首要任务。对于细胞表面分子，最直接的策略便是利用专一抗原的抗体来抑制其作用。在这个过程中，可以利用ique® 高通量流式细胞仪在短短5分钟内完成96孔板的b细胞筛选。同时，在抗体生产过程中，亲和力和浓度是最关键的两点，octet® 非标记分子互作系统的检测可以提供精准信息。最后，验证抗体效果时，我们会使用incucyte®，该设备能够实时监测细胞的增殖和死亡等指标。
为什么如此多cns文章选用incucyte® 来进行活细胞成像实验呢？
长时程，不闲置：培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔自动拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害
通量高，通用性强：6个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿；
智能化拍摄，ai分析：高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数；
完整解决方案：大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的protocol；文章数大于14,000篇，是长时间活细胞成像产品
多种应用的配套拍摄模式：针对3d类器官/肿瘤球、线粒体膜电位、神经突、血管生成等应用都有配套的拍摄及分析模式
-参考文献-
[1] nlrp12-panoptosome activates panoptosis and pathology in response to heme and pamps. cell. 2023 jun 22;186(13):2783-2801
[2] inhibiting membrane rupture with ninj1 antibodies limits tissue injury. nature. 2023 jun;618(7967):1072-1077.
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值得注意的是，在文章中，incucyte® 实时活细胞分析系统显著地推动了这项研究，并承担了整个实验约80%的工作量，成为构筑论文主体的关键工具。那么，文章是如何应用incucyte® 的呢？
先天免疫是由病原体、病原相关分子模式（pamp）或损伤相关分子模式（damp）激活引起的，增强的免疫激活可导致细胞损伤、组织破坏和器官损伤，以及damp的释放（图1）。模式识别受体（ppr）因其可以感知非特异性pamp或damp的能力而被经典研究，然而，多种pamp和damp对prr的联合激活尚未得到很好的表征。
图1.红细胞破裂、damp释放、联合pamp激发下游信号通路导致细胞死亡
万事开头难，研究人员首先需要建立体外模拟感染并驱动先天免疫和炎症细胞死亡的模型。如图2所示，研究人员选择多种damp、pamp及其组合的诱导细胞死亡的分子，以骨髓源性巨噬细胞(bmdm)为模型，应用incucyte® 检测（图2），结果显示：单独的pamppam3、poly(i:c)、lps或r848处理骨髓源性巨噬细胞(bmdm)，触发死亡比例低。然而，组合pamp在许多组合中都会诱导大量细胞死亡（图2）。同样，单个damp不会诱导bmdm中的细胞死亡，damp的组合也不会诱导细胞死亡。pamp与damp的组合中血红素与pam3、lps或r848的组合细胞死亡反应强烈。由此表明，由特定pamp组合驱动的信号传导以及血红素与pamp的组合可以诱导强烈的细胞死亡。
图2.各种诱导剂组合的细胞死亡代表性图片以及定量图；incucyte® 可以自动获取48小时内pi染色的图像，允许明场和荧光通道的重叠，并标记阳性信号，通过设定分析阈值和背景扣除算法，自动定量分析pi阳性细胞的比例
遵循图1的研究路线，接下来的任务是通过干扰中间受体和信号分子，来探究是否能改变细胞死亡的表型。在这一步骤中，incucyte® 的高通量自动成像和分析功能将全面支持本文的研究，全程自动记录并分析细胞死亡的比例。
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在这篇文章中，无论是测试病原相关分子模式（pamp）、损伤相关分子模式（damp）及其组合对细胞死亡的影响，还是后续干扰中间信号分子以观察细胞死亡情况，都涉及到浓度和时间点的精准控制。这时，incucyte® 的实时监测功能就大显神威了，它可以实时检测并确定细胞死亡的最高时间点和最佳浓度，显著降低实验工作量，提高科研效率。
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图5.incucyte® 每半小时检测一次dd150阳性细胞比例，质膜破裂的细胞为阴性细胞，蓝色为clone d1曲线，0.1μg/ml浓度就能达到很好的抑制效果。
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[1] nlrp12-panoptosome activates panoptosis and pathology in response to heme and pamps. cell. 2023 jun 22;186(13):2783-2801
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